目前实验在测定从细胞萃出之蛋白的caspase的活性 有从两方面进行实验 一个是作western bloting 另一则是利用比色法 但主要还是利用colorimetric来测定 实验步骤如下: 细胞用不同浓度的药物作用同样时间後 1. 利用kit所附之lysis buffer破细胞 取上清液 2. 测定蛋白浓度,用Q水调整至一样的浓度(100-200ug) 3. 加入reaction buffer 4. 加入substrate 5. 37度作用 2hr 6. 测-405nm 测出来的数据 常会中间的某一个浓度 测出的OD值会突然掉下去 整个很没趋势性 想问问 会导致没有趋势性的原因可能有哪些? 我自己有想到几个问题 1. 蛋白浓度测定不准 但跑SDS-PAGE 看actin量并无明显差异... 2. 因蛋白液有黏性 导致实际加下去作用的体积有误差? 3. Substrate本身需避光储存 所以在实验时96well plate需避光? 4. 混合液体时间过长(因会同时进行2-3组的细胞) 5. 调整蛋白浓度时 使用kit附的dilution buffer有利作用? 6. .....? 落落长的文章~ 这实验实在让我很困扰呀 阿kit又很贵 看到数据出来心都凉了... 请有经验的高手们帮帮忙罗 感谢啦 --

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