我後来跑出来了! 但其实就很奇妙 抓不出PCP成功and不成功的原因XD 给大家参考一下: 转Bisulfite改用2ug去转-->产物10ul-->取4ul(用260推算浓度,则是130ng左右) -->去PCR跑温度梯度 这个条件的产物跑胶超明显 但同一批的Sample同条件 我隔天再跑产物跑gel就变弱超多的 但还好够我做TA cloning 也有挑到我要的clones 去做sequencing分析 後来也有再尝试看用当天转bisufite的sample去repeat一次实验 想看看是不是bisulfite处理的sample一定要很"新鲜"的跑 结果 同样的条件温度 就没P出来了 所以 还是很谜样的没有结论~ 之後有新的发现再跟大家说~!! ※ 引述《monicatsen (monicatsen)》之铭言： : 想请问有在做DNA bisulfite PCR的各位 : 我目前的实验构想 : 是想去看在表现我目标基因的细胞 : 在一些stemness上甲基化程度是否受到影响 : 所以我的实验流程如下: : bisulfite sequence : 1.抽control及表现我目标基因细胞的gnomic DNA : 2.ZYMO DNA methylation kit : 去modified gnomic DNA : (500ng,是protocol建议的量) : 3.ZYMO产物 : 用吸光值推算浓度,取100ng量跑PCR(用Hot star的DNA polymerase) : 4.PCR product直接送定序 : (因为还不知道会被甲基化的位置，所以想先用这种方式粗略的先分析) : 但我目前的问题是: : 1.PCR没产物 : 这里用的PCR primer : primer的序列没有CG所以只需考虑C-->T的规则 : Tm分别为=48&55 (可以想到可能是两个温度差的太大了一点) : 2.ZYMO KIT处理完後,其实产物的浓度不高, : 一次的产物大概只能够我做一次PCR, : 所以要跑gradient PCR对我而言有点为难阿， : 所以想问大家做後面PCR分析会用多少的DNA? : 想问大家的看法及建议,谢谢! --

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