作者monicatsen (monicatsen)
看板Biotech
标题[求救]bisulfite Genomic PCR疑问
时间Wed Aug 15 17:46:44 2012
想请问有在做DNA bisulfite PCR的各位
我目前的实验构想
是想去看在表现我目标基因的细胞
在一些stemness上甲基化程度是否受到影响
所以我的实验流程如下:
bisulfite sequence
1.抽control及表现我目标基因细胞的gnomic DNA
2.ZYMO DNA methylation kit
去modified gnomic DNA
(500ng,是protocol建议的量)
3.ZYMO产物
用吸光值推算浓度,取100ng量跑PCR(用Hot star的DNA polymerase)
4.PCR product直接送定序
(因为还不知道会被甲基化的位置，所以想先用这种方式粗略的先分析)
但我目前的问题是:
1.PCR没产物
这里用的PCR primer
primer的序列没有CG所以只需考虑C-->T的规则
Tm分别为=48&55 (可以想到可能是两个温度差的太大了一点)
2.ZYMO KIT处理完後,其实产物的浓度不高,
一次的产物大概只能够我做一次PCR,
所以要跑gradient PCR对我而言有点为难阿，
所以想问大家做後面PCR分析会用多少的DNA?
想问大家的看法及建议,谢谢!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.52.35
1F：推 datro:100 ng biDNA太高 converting过後 吸光值很不准 通常我是当 08/16 02:15
2F：→ datro:当成100%转换 稀释後取10~20 ng的量去跑PCR 08/16 02:15
3F：→ datro:然後 PCR product直接定序 传统定序讯号可能会很乱 08/16 02:16
4F：→ datro:通常不是接TA 定clone 就是用pyro-sequence的方式做会比较好 08/16 02:17
5F：推 dingoxp:之前也有过PCR没产物 并且BS处理完浓度更低 08/23 20:39
6F：→ dingoxp:後来换个Taq与buffer就可以了 主要是因产物有二级结构 08/23 20:41
7F：→ travelmat:我是跑出来smear，没专一性BAND ㄒ_ㄒ 08/29 12:27