作者jkq (玩具)
看板Biotech
标题[求救] 我的PCR primer 是不是有问题
时间Wed Jul 18 09:32:43 2012
目前为了找出白虾里的血蓝素
采了组织 抽了RNA 翻了cDNA
但到了我们要利用设计好的primer 去夹
却始终夹不出来 连用梯度去跑 也没东西
想请问看看 是我们的primer有问题 还是哪里出了问题
这是白虾的血蓝素序列 cDNA 浓度则是4.9 ug/ul
http://ppt.cc/tvMU
而我们设计了两组primer 加上切位 CCCGGG和CTGCAG
F-5'-AT CCC GGG G AAATGGGAATTTTCAGAATG-3'
R-5'-AT CTG CAG TGCATATGTTCTTTATTGTGG -3
F-5'-AT CCC GGG C ATGAAATGGGAATTTTCAGA -3
R-5'-AT CTG CAG AAACAATTCATTCATCGACA -3
配法
cDNA 1
PCR buffer 1
2.5 mM dNTP 1
1/5x 稀释 Primers 0.2
Taq DNA polymerase 0.1
ddH_2O 6.7
total 10
这是我们的梯度PCR program
Stage1 Stage2(35cycles) Stage3
95℃ 94℃ 55~65℃ 72℃ 72℃ 4℃
5min 30 sec 1 min 2 min 10 min Hold
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.59.89.34
※ 编辑: jkq 来自: 210.59.89.34 (07/18 09:36)
※ 编辑: jkq 来自: 210.59.89.34 (07/18 09:44)
1F：→ skybreeze:要不要先找一组一定夹得出东西的primer看看sample有无 07/18 13:02
2F：→ skybreeze:问题 07/18 13:02
3F：推 sunnyforever:可能cDNA浓度太高吧 再稀释看看 07/18 13:08
4F：→ jihyang:我拿你的序列去比对 怎麽都没对应到? 可以说一下 从哪里 07/18 13:13
5F：→ jihyang:开始吗? 07/18 13:13
6F：→ jihyang:另一方面，RNA抽出来的品质 还ok吗? 07/18 13:15
7F：→ jkq:序列不是从CDS开始 而是从在前面一点的mRNA序列开始 07/18 13:24
8F：→ jkq:因为试过直接从序列开始和结束处 直接设计 但GC值会太高 07/18 13:25
9F：→ jkq:另外切位後面多加的C或G 只是为了上他接上vector的时候 07/18 13:26
10F：→ jkq:能呈现三字组 07/18 13:27
11F：→ Ianthegood:cDNA先稀释个一百倍吧 体积不同有时候结果也会不一样 07/18 14:18
12F：→ Ianthegood:然後gradient可以从50开始拉吧 07/18 14:19
13F：→ blence:看到这个cDNA浓度，应该是RT完之後拿去测的吧... 07/18 15:52
14F：→ handolu:cDNA浓度要再稀释个10倍吧，序列找不到+1 07/18 17:11
15F：→ jkq:请问pcr浓度多少才适合呢 07/18 18:28
16F：→ jkq:序列为AAATGGGAATTTTCAGAATG 07/18 19:57
17F：→ jkq:切位後 就是序列 但不是设计在血蓝素本身 07/18 19:59
18F：→ RickyKckao:一般50uL的PCR我都取1~2ug的template来P 07/21 02:12