作者emilyliu (微笑下的真实)
看板Biotech
标题[求救] 跑western几个步骤上的问题
时间Tue Jul 17 21:46:57 2012
各位板友好 几个有关western的问题想请教
1. overnight的话 停在blocking或上一抗overnight (一样都放在冰箱摇)
或者200mA transfer 这三种都有看过，请问比较建议停在哪一个步骤？
三者对於band会有影响吗？
2. 上抗体後(不论一抗二抗)放在冰箱或室温下摇对实验会有影响吗？
看过有的实验室不管一抗二抗一定都放冰箱，有的却是都放在室温而已？
3. 我跑的检体主要是动物组织，常常会有background 很脏，band不够sharp
的问题有尝试增加wash的次数，不过效果似乎有限，之前有听朋友说过可以
延长二抗的时间，(我二抗时间一个小时，他说他是四个小时放冰箱) ，我
还没有试过，想了很久不是很懂为什麽？至於跑出来的band常常会糊糊的不
够sharp，有加过trypsin，但是band常常会跑掉，和原本在该出现的位置会
有一点落差，裁membrane常常会裁到有点困扰，效果似乎也还好，
想请教板友有什麽方法可以改善吗？
我知道每间实验室对於跑western都有自己的protocol，我想请教的是，
像transfer的时间 (400mA 2~4hr 或200mA overnight) ，上抗时间的
长短(Ex: overnight 和两个小时）对於跑出来band好不好的影响在哪里？
问题有点多，希望有板友能指教 谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.46.149.183
1F：→ RickyKckao:之前听学姐说室温下抗体binding较快 4度C binding较慢 07/18 01:43
2F：→ RickyKckao:但比较不会有non-specific binding 07/18 01:43
3F：→ RickyKckao:所以低温下要放比较久 不知道是不是正确的@@ 07/18 01:44
4F：→ RickyKckao:二抗稀释多一点background应该会少一点 07/18 01:46
5F：推 dennisyoung7:background可能也跟用的ECL reagent 浓度有关 07/18 02:14
6F：→ theowing:有些protocol会写室温一小时或4C过夜 07/20 04:44
7F：→ theowing:如果跟抗体很熟可以自由组合 若要确保好看的结果 07/20 04:44
8F：→ theowing:就一抗二抗都过夜在冰箱摇 07/20 04:45