作者qacvb (朝气)
看板Biotech
标题[求救] 大分子SDS-PAGE & transfer 条件
时间Thu Jul 5 19:49:30 2012
最近正在做 ATM(350kd) Western blot,由於是新手
最近试了几次, 以5% resolving gel跑 60V,30min + 100V, 90min,
transfer完之後, 今天看结果, 发现根本没有东西= =+
想请教有经验的大家, 像ATM这种大蛋白
1.跑SDS-PAGE 该用多少% 的resolving gel? 以及电压和时间的控制是多少为宜?
系统是 Mini-PROTEAN®Tetra Cell
http://0rz.tw/8XCrB 厚度1.5mm
2.至於transfer的电压/电流条件和时间约多少较适当?需要O/N吗?
磷酸化的ATM 除了lysis时要另加 phosphatase inhibitor外还有其他要注意的吗?
使用的是全湿式 Mini Trans-Blot®Cell
http://0rz.tw/dVnGj
先谢谢大家的不吝指教, 感激不尽~^^
PS:补上抗体资讯
ATM:
http://www.cellsignal.com/products/2873.html
p-ATM:
http://www.cellsignal.com/products/4526.html
麻烦大家了 感激不尽 Orz
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.32.245.199
1F：→ blence:你的transfer时间多久? 这麽高的位置无法用marker当对照喔 07/05 19:57
2F：→ qacvb:400mA,2.5h,选用的marker是到315kd 07/05 20:01
3F：→ blence:大蛋白放O/N是比较好,不过这样的条件应该也可以看到,确认你 07/05 21:13
4F：→ blence:的Ab是否好用,至於pS1981则需要postive con比较知道问题 07/05 21:15
5F：推 owl628:你要不要把你实验详细过程寄站内信给我,我还满常跑ATM的WB 07/05 22:59
※ 编辑: qacvb 来自: 114.32.245.199 (07/06 01:44)