大家好，我目前已经购买ROCHE TUNEL Fluorescein kit这一组 我想请教一些问题！ 我的组织是脑切片，前面有先用灌流（PFA）後有脱水，目前已经冷冻 切片了（40um一片） 因为实验室或者邻近的实验室（我们所很小只有五个老师＠＠）没有人使用这组kit 或者没人做tunel所以没人可以请教，所以想问有使用过这组kit的人，拜托了！ 已经准备好的切片，我看他的protocol如下（框内有我想问的问题） 先用PFA固定 (问题1.我的切片已经用PFA固定是否还要做此步骤？) 用PBS WASH，为了保存请用纯酒精在低温-15~-25度让切片脱水 （问题2.是否一定要做此步骤？因为我的切片已经用3%蔗糖脱水过） 使用Permeabilisation solution 於冰上反应两分钟 （问题3.这个solution的配方为0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate， 请问这个配方中的sodium citrate作用为何？？是泡在PBS中吗？ 问题4.因为我还要染BrdU也是萤光染色，前面步骤需使用0.1% Triton X-100 in PBS 想请问同时染BrdU and TUNEL这个增加细胞膜的步骤，是否只需要一次？而且使用 0.1% Triton X-100 in PBS 即可？因为唯一差别在sodium citrate上） 接下来有疑惑的地方 (问题5.他protocol写tissues 是用一种方法，如果是difficult tissues又是另一种 方法，虽然他有写difficult tissues为dewax paraformaldehyde- or formalin tissue 但是不知道我之前处理我的切片时，是否也属於这个difficult tissues？？） 我先问一般tissue方法： 用PBS RINSE两次，之後将切片周围弄乾，加入TUNEL REACTION MIXTURE，在盖上盖玻片 後放於37度避光状态下反应一小时 （问题6.我们的切片染色一组约14片同时放在同一个WELL染，我看TUNEL REACTION MIXTURE用量极少，PROTOCOL又写把周围用乾，是否因为要将切片先贴在玻片上？ 问题7.他说TUNEL REACTION MIXTURE为 enzyme solution取50ul label solution取 450ul 这个量可以做10个sample ，所以一个sample只需要50ul，但是我的脑切片面 积很小，只需要10ul後盖上盖玻片，即可将液体均匀分布！所以是否我取 enzyme solution：label solution ＝ 1:9 最少量为10ul就够了？？怕减少量会降低 效果） 用pbs wash 三次，後放到萤光显微镜即可观察到 （问题8.此时再把切片从玻片上取下放到well清洗吗？？） 不好意思，第一次使用也没人可以教...很多问题，希望能有所解答！ 因为内容很多，希望直接寄站内信给我！非常感谢><"拜托大家了！！！ --

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