我用的是NEB的酵素 1. NsiI 37°C 有活性 2. BstBI 65°C 有活性 两个酵素一起反应的话，NEB网站有说: Digest in NEBuffer EcoRI at 37°C with NsiI, then add BstBI and raise temperature to 65°C. This buffer is not supplied with either enzyme. 所以我buffer选用NEBuffer EcoRI 我实验步骤也依照他说的，先加NsiI下去反应37°C，然後再加BstBI放到65°C下反应 结果跑胶之後，DNA都卡在well上面... 於是我分开做实验 1.单纯只加NsiI下去反应37°C ----> 有切成功! 2.单纯只加BstBI放到65°C下反应 ----> 有切成功，可是效率不好~ 3.换buffer NO.2,3 or 4 先加NsiI下去反应37°C，然後再加BstBI放到65°C下反应 -----> 一样DNA都卡在well上面... 有人有遇过这样的问题吗? 我真的卡住了~>"< --

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