作者ElmoPU (pupu)
看板Biotech
标题[求救] internal ctrl出不来
时间Mon May 7 00:01:02 2012
最近遇上了怪事
进行western blot
无论是跑学姊的sample 或是我自己的sample
GAPDH怎麽样就是出不来 或是很弱
(压片1分钟还是淡到不行,以往10秒就超强
1st Ab是1:8000,2nd Ab是1;10000)
但是其他的蛋白就都可以detect到
甚至改压beta-actin就出的来
(所以确认并非sample本身有问题)
本来学姊推论是否是小於40kD都出不来
可能是running或transfer bfr有问题
(因为我刚好有配新的,怀疑可能有配错)
但是我向其他人借了bfr跑出来
跟以往一样 有一个14kD的蛋白一样可以detect到
而且signal还很强 所以显示并非小於40kD就无法detect
1抗也换过5支了而且都是别人确定是work的
2抗也有换过了
我实在不知道还有哪里可能会有问题...
有可能是washing bfr吗?
但是这样不是应该整片都有问题?
而那个range(约莫26-43kD)去hybrid另一个测phosphorylation的1抗
即使是压片1秒也是一片黑
但是别人用同样的抗体 就不会
有可能是我哪个环节出了问题才导致这个问题的产生呢?
PS半个月之前,一切都很ok,GAPDH都很美丽的阿....
这段期间,washing和transfer bfr有重新配过stock
然後Tris pH8.8也有补充
有换的东西应该就只有这三样
已经确认running和transfer bfr应该是没问题的
(因为用别人的跑一样压不出GAPDH)
请问有人知道有什麽会造成这问题吗?
谢谢!!!
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◆ From: 118.169.215.217
1F：→ justname:请别人帮你跑一次看看? 05/07 00:32
2F：推 FireHell:一抗是不是有REUSE? 有的话重配 05/07 02:58
3F：→ ElmoPU:一抗是reuse没错，但也已试过重配仍然不行。 05/07 08:38
4F：→ ElmoPU:请别人跑是最後方法了，毕竟大家都很忙... 05/07 08:39
5F：→ ElmoPU:我现在怀疑的是Tris pH8.8和washing bfr 05/07 08:40
6F：→ ElmoPU:但实在没道理整张membrane就那里有问题... 05/07 08:40
7F：推 FireHell:一抗哪一家的？我是觉得配太稀了 05/07 15:14
8F：推 windyflyer:我们家的gapdh一抗1:10000 二抗1:7000 这样就很亮了0.0 05/08 15:33