作者aggaci (可找我下棋..)
看板Biotech
标题[讨论] 关於一个His-tag pull down的问题
时间Sat Apr 14 23:34:25 2012
请问大家一下
最近在做His-tag pull down assay
我把6H-A(A是我的蛋白质)加到cell lysate里
反应完後加Ni2+ resin把6H-A抓下来
目地是想看a是否会跟其它蛋白质结合....
我bead洗完後直接加2X sample buffer拿去煮再连bead一起loading
我把a分子量附近的page切下来用CBR染色
结果我并没发现a的蛋白质
(我纳闷了好久..........我确定6H-A可以结合Ni2+ resin)
我能想到的惟一原因是a还结合在resin上并没朝正极移动，
因为6H跟Ni2+结合能力很强
有没可能是这样??
若是这样那下次恐怕得用imidazole elute出来再跑了
若不是..........我还真的一时想不到原因.....
谢谢
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◆ From: 140.116.253.121
1F：→ blence:in vitro pulldown後直接加PSB煮都可以看到蛋白阿,该不会你 04/14 23:56
2F：→ blence:加的His-tags不多,还用CBR的话就看不到了 04/14 23:57
3F：推 joseph103331:做pull down assay要用抗体侦测吧? 那量在CBR看不看 04/15 23:51
4F：→ joseph103331:得到真的很难讲 建议你用抗体看看比较好 04/15 23:52
5F：→ joseph103331:毕竟你也不是做纯化嘛 04/15 23:52
6F：→ aggaci:我想您说的是ip...我的是用大量recombinant protein去抓欧 04/16 16:49
7F：→ aggaci:我後来用imidazole去elute时ok，我得再做一次 04/16 16:50