作者libraq (Sky)
看板Biotech
标题[求救] Trizol前可以用PBS wash?
时间Fri Apr 6 22:00:56 2012
我们实验室是用trizol来抽cell line RNA,依说明书说加入前不要用PBS wash cell
问题在加入萃取物处理细胞後,抽出的RNA pellet似乎都会有残留萃取物(灰绿色),
虽然用nanodrop测出来的量、260/280、260/230都算正常,
但不知道为什麽某些组萃取物会导致跑qPCR时,18S都莫名其妙少了快两个CT,
我推测是因为萃取物会与RNA共沉淀,导致RTase的活性被抑制,使得RT没那麽好
因为已经做了三次实验,某几组萃取物都有同样的结果,应该不是实验人为误差
虽然说CT值都勉强在线性范围内,但总觉得有点毛毛的.
查了网路上,有lab protocol说加入trizol前要cold PBS wash,
有人表示colde PBS wash後,抽出的RNA表现量会大乱,
invitrogen也说wash後会导致RNA degradation.
请问到底能不能用PBS wash呢?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.218.97
1F：推 joseph103331:用PBS wash为什麽会导致degrade? 细胞又还没破.... 04/06 23:54
http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
我也很好奇，在第二页写到
Do not wash cells before addition of TRIzol® Reagent to avoid increased
chance of mRNA degradation.
※ 编辑: libraq 来自: 140.112.218.97 (04/07 00:05)
2F：→ cmublue:我们家是invitrogen的Trizol有分别试过有无PBS的wash步骤 04/07 01:31
3F：→ cmublue:realtime结果还算正常 04/07 01:31
4F：→ skyken10:我猜会不会Cold PBS会产生Cold shock~所以不建议使用 04/07 01:37
5F：推 sunlen:我分离b细胞..分离过程很多PBS wash最後还是可以抽RNA 04/07 03:01
6F：推 icome:是怕洗太大力会破掉? 反正能不洗就不洗 04/07 09:51
7F：→ ararthur:怕是PBS里有RNase吧 若真的有 残留一点就有差了 04/12 00:59
8F：→ ararthur:不过我从来都没有看过灰绿色残留物... 这里问题比较关键 04/12 01:00
9F：→ libraq:谢谢大家,最後还是洗了,也找了些paper,找到可能问题的部份 04/12 01:49