作者kohkoe (kohkoe)
看板Biotech
标题[求救] Western：Protein ladder消失
时间Fri Mar 30 03:55:56 2012
小弟最近遇到Western的问题，
最近跑SDS-PAGE时protein ladder会在电泳过程中逐渐消失扩散，最後几乎全不见，
但gel底部的dye很清楚，认为蛋白质应该没跳海，不过我这几天开始怀疑了...
以下是transfer前，gel染CBR的图片
http://ppt.cc/wHDR
如图所示，左边ladder约只剩100和70kDa还看得到，其他位置已经不见了；band也变很淡
且很多位置的band都消失了，背景可看到蛋白质跑过的痕迹。
我电泳的条件是，
5% stacking gel, 10% running gel, 定100V跑1小时50分钟.
蛋白质loading量为40 ug, load体积5 uL的protein ladder及20 uL的samples.
我已排除protein ladder的问题，因为是新买的且有人跑很清楚没问题。
我running buffer重新配(pH8.3)，但近3次跑仍然ladder消失(最後连b-actin都看不到)
目前我认为可能是gel的问题或跑电泳电压的问题(虽然我之前跑10次以上都没问题)
请各位大大分析可能的问题，我该如何做？
先用低电压(60V)再用高电压(100V)跑吗？或增加gel的浓度比率？
最後，另想问两个问题，
1. 即使dye没跳海，上面的蛋白质有可能先跳海吗？
2. sample loading的体积会影响跑胶吗(如load 4 uL和20 uL有差吗)？
以上
谢谢各位耐心的大大看完我的问题！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 203.71.94.11
补上transfer後的图
http://ppt.cc/TptN
可看到ladder的颜色都扩散了，红色已扩散到下面了。
这时间还在实验室请各位务必帮小弟troubleshoot 拜托了！
※ 编辑: kohkoe 来自: 203.71.94.11 (03/30 04:53)
1F：→ Invec:感觉有点像running buffer太热造成的效果 03/30 05:47
2F：推 tsubasawolfy:如果你其他条件都跟以前一致 那先从做胶的东西开始 03/30 07:42
3F：→ tsubasawolfy:换呢？下胶的buffer, acrylamide这两个 03/30 07:43
4F：→ kohkoe:胶的buffer我已经配新的了 03/30 10:05
5F：→ kohkoe:band消失有可能是gel过热? 但我的band跑很平耶 03/30 10:08
6F：→ lovesteve:应该是running buffer太热,我们之前也有过一样状况 03/30 10:20
7F：→ kohkoe:那该怎麽解决? 放冰上跑吗 03/30 11:53
8F：→ blence:不需放冰上,如果100V还会gel过热,就要检查各种buffer配法 03/30 12:26
9F：→ mars52013146:查过transfer buffer 的ph值了吗? 03/30 12:41
10F：→ kohkoe:楼上 我目前问题是卡在跑胶 03/30 13:40
11F：→ kohkoe:我确认过running buffer配法没问题... 03/30 13:42
12F：→ kohkoe:有可能是配胶的10% SDS的问题吗 这个我没配新的 03/30 13:48
13F：推 mesenchymal:之前我们lab SDS坏掉,跑出来的胶也是很怪 03/30 16:15
14F：→ mesenchymal:72 KDa红色那条跑到95 KDa上面去 03/30 16:17
15F：推 pichia:为什麽不换个Ladder试看看 03/30 16:22
16F：→ blence:最近running或gel prep新配了什麽,就是什麽那个出错了 03/30 17:32
17F：→ blence:尤其是Tris-HCl最常先用完,然後配新的就出问题 03/30 17:35