作者e2653495 (melanogaster)
看板Biotech
标题Re: [求救] long pcr p不出来
时间Tue Mar 27 18:15:43 2012
※ 引述《sylvialalala (sylvia)》之铭言：
: 目标是15k的genomic dna
: 使用了好几种方法都P不出来
: Polymerase是kapa的long range hotstart pcr
: 号称最多可P到20k
: 我的做法:
: 一开始怎麽P都是smear，怀疑是primer太短(20 bp)_
有smear是product还是template?
在product表示Ｐ到很多东西，很杂，专一性不够
（可能是primer，可能是PCR条件没抓好）
如果是 template表示DNA断光光，要Ｐ出东西会有困难，
也有可能是template浓度太高，请稀释。
建议你采取nest PCR方式进行。
还有Ｐ的cycle数那麽多，extension 时间又那麽长，你的polymerase後面还够力吗？
以上，建议一下下。
: 後来改成28~30 bp的primer去p
: 一开始夹不到东西，後来降低annealing温度(TM-10度)
: 还有加上普通的TAG(TOP TEN)以1:1,16:1去P
: 夹的到东西但都是10K以下
: 有加上NESTED方法去P但都是SMEAR
: 做法是根据PROTOCAL
: 94度C 3分
: 94 25秒
: tm-10 15秒
: 68 15分 共10 cycle
: 94 25秒
: tm-5 15秒
: 68 15分加上每cycle增加20秒 共25cycle
: 72度c 15分
: 请问我该怎麽调整呢
: 谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.95.98
※ 编辑: e2653495 来自: 140.114.95.98 (03/27 18:17)
1F：→ sylvialalala:谢谢！我smear是product!可是primer有blast过应该专 03/27 21:21
2F：→ sylvialalala:一性蛮好的？我的extention是根据kapa建议1kb/1m, 03/27 21:21
3F：→ sylvialalala:KAPA号称可以p到20k，所以酵素应该不会有问题？目前 03/27 21:22
4F：→ sylvialalala:有用nest方式在试试看，只是买了kapa就是想一次p长 03/27 21:22
5F：→ sylvialalala:一点～～～好苦恼 03/27 21:23
6F：推 lyu0001:如果是要拼human genomic DNA，找一下BAC clone 03/28 14:20
7F：→ lyu0001:有没有你要的片段 03/28 14:21