作者aceliang (炸虾沾酿)
看板Biotech
标题[求救] miRNA做real-time
时间Wed Feb 29 01:18:07 2012
各位好，小弟最近在做miRNA的real-time，遇到点问题请教...
1. 目前我个人的作法是Total RNA抽出来(TRIZol)，取定量(约5ug)做
polyadenylation (用polyA polymerase + ATP, NEB)，之後直接取1/10体积
用Oligo dT转RT (SuperScriptIII, Invitrogen)。之後产物cDNA去跑real-time
Control都会用U6，目前为止都很稳定，但是miRNA的表现却很跳痛。
该高不高，该低不低，重复的样本也会上上下下。实在很难定量分析。
想请问有没有更好的方法？
2. 有一说是RT用stem-loop primer去做类似RACE，会有比较高的专一性
对於mature vs. precursor miRNA比较能做(结构上的)区分。
不知道板上先进的建议是？
3. 目前小弟使用KAPA的2X master mix，机器是StepOne plus，
某些target容易跑出multiple Tm peak，salesperson是给我建议说
把reagent再稀释些，这麽做难道还要try稀释条件？还是有个大略值呢？
几个问题请教，还请高手协助～喔耶～
--
这个嘛...
http://aceliang.pixnet.net/album
http://www.wretch.cc/album/
http://123.342.123.321.231.321
选哪个好呢？
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.135.72.79
1F：推 kingbar:miRNA的precusor和mature form都没有poly A喔~ 02/29 12:54
2F：→ kingbar:用Oligo dT当然转不出来，好奇你real-time如何设计primer? 02/29 12:56
3F：推 HEK293:有 polyA tailing 02/29 18:11
4F：推 huuban:看你是要增幅mature还是precusor吧，方法不太一样 02/29 22:50
5F：→ huuban:很好奇你的primer是怎麽设计？ 02/29 22:51
6F：→ aceliang:目标是要做mature，所以才想说原方法可能不够好 02/29 22:56
7F：→ aceliang:primer有两组抄自publication，一组用Primer express设计 02/29 22:57
8F：推 kingbar:喔喔~不好意思，我没看清楚原PO有做polyadenylation 03/01 00:48
9F：→ huuban:mature用Oligo dT是做不出来的啦，mature miRNA没有polyA 03/01 00:52
10F：→ huuban:如果你有polyadenylation, 还是很难説 03/01 00:53
11F：→ huuban:因为有些 miRNA 讯号真的很低，一般的方法可能会看不到 03/01 00:54
12F：→ huuban:假使你有资料可以参考，看看他们是用什麽方式吧 03/01 00:55
13F：→ huuban:目前我知道的也仅有 Taqman 和 LNA 两种，抱歉孤陋寡闻 / \ 03/01 00:56
14F：→ aceliang:h大快别这麽说！您已经给小弟相当建议了！谢谢 03/01 18:59
15F：→ aceliang:我好奇说如果我用stem-loop转RT，那internal control要？ 03/01 19:00
16F：推 conan11:miRNA要用特别的internal control 如U6,U3 03/02 09:31
17F：→ conan11:ABI有很多可以挑，当然也可以自己合成 03/02 09:32
18F：推 jabari:kapa mm是sybr不饱和萤光, 可改用Evagreen 系统 03/03 00:19
19F：→ RickyKckao:internal control 可以用snoRNA-412 03/04 11:05
20F：→ aceliang:感谢以上各位的建议！看来我有得试了XD 03/05 21:23