作者mkmai0802 (Wengda)
看板Biotech
标题[求救] 用kit抽plasmids
时间Fri Feb 24 18:27:19 2012
各位大大您好
小弟最近将一个基因接到一个plasmid载体上後 !
转型到DH5-alpha内, 涂盘挑single colony !
再O/N培养, 之後取 2.5 ml 的菌液用kit抽plasmids ~
用厂商的elution buffer回溶 100 ul ! 也用这 elution buffer 当Blank !
测出来的浓度约是50-100 ng/ul ,
之後再分四管 , 每管约150ng plasmids
(1) 用EcoRI+HindIII切两刀
(2) 用EcoRI切一刀
(3) 用HindIII切一刀
(4) 都没切
再去跑1%的Agarose gel !
问题来了 第1-3的位置都比 4的位置(下面)小一点
因为切开了 所以长度比较正确 ! (这应该没问题)
问题在於1 , 一没有出现 我想要的band !
老师说可能是我算错浓度 ! 浓度太高 所以切不动 = = !
所以想问问 抽出来的plasmids 这样的浓度合理吗 ?
他叫我 要放到 3-4 ug ! 可是我抽出来的量 没那麽多啊 ><
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我爱你 用生命的爱 ~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 203.64.80.74
1F：推 iamwi:会不会很衰的是两个质体互相接起来了~因为没看到做AP或CIP 02/24 18:37
2F：推 TAKONA:plasmid size正确吗？你定序过确定里头有insert？ 02/24 20:11
3F：推 dodomilk:问题同二楼，你有作colony PCR看有没有接近去吗？ 02/24 20:25
4F：→ dodomilk:你们老师应该没做过实验吧...这两个RE随便切都切一大堆 02/24 20:26
5F：推 tsubasawolfy:理论上高度 2=3>4>1才对吧 1=2=3? 02/24 23:55
6F：推 tsubasawolfy:用ta系统照厂商条件做很难失败 该不会你只挑1颗? 02/24 23:59
7F：推 huuban:2跟3的位置一样吗 02/25 01:29
8F：推 Realthugz:怎麽可能... 你是用口水切吗 单位ug都照切好吗... 02/25 18:19
9F：→ Realthugz:plasmid拿去PCR一下 夹出你的片段 准确又省DNA 02/25 18:21