【问题】： 如何找出PRIMER与template的condition 【问题起因】： 现在我有一组sample做为control，在这组control理论上是不会被primer 黏上，也就是应该 "不会有BAND" 出现 但跑出来结果有BAND产生，所以现在想法在於condition问题 以下这想法不确定正不正确 "只要condition合适，不论primer与template是不是在序列上有没有match 有可能有"一定机率"做出产物" 也就是比如anneling温度极低，使某CYCLE PCR不小心黏上做出东西 那麽这样的错误就会被放大 (也就是该错误变成template，然後做出产物) 基於这样的想法 (不确定这想法对不对) 要求证，想透过是否有软体能计算 primer跟template在怎样的条件下会match并做出primer 我有试过用mac vector，但似乎只会跟你讲说 这primer不会match之类 (也有可能我操作不熟，或有我不知的方法) 而我要求的是在怎样他们才会match，不论条件多极端 【个人看法】： 主要因为我实验的PCR是在非常低的anneling温度，想知道这样条件是否就是问题 而同组control不同次的实验 (一样sample一样condition，差别只在先後) 却有不同的结果。 再尽力避免人为失误之下，考虑是污染被放大的情况 也就是不正常环境下的match 感谢各位 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.130.105 有试过 我是这样配置 1.negative controll(不应该有band) ----> dna+ez+.... --> pcr 2. ----> dna+water ---> pcr 3. -----> water 前两组用的DNA一样，都是不应该被PRIMER黏上的TEMPLATE 结果是有加enzyne的，做完pcr 有band -------> 不应该有 没加enzyme是完全没东西 -------> 正常 所以感觉就是primer不知为啥会黏出东西 可能是tm值问题 但tm值目前是不可能变动，不然实验组也弄不出来 control条件又需和实验组一样，不然不叫control组 所以才想知道有无办法知啥情况下，本应不该黏上的却可以黏上 这样就可以把control去掉 ※ 编辑: travelmat 来自: 59.126.67.149 (02/22 11:34) 所以我才想要知道在怎样的条件下 才会产生这种不该BIND却BIND上去，而做出产物的情况 我想知道那个CONDITION，比如TM值，或是其他东西 (而我希望有软体或是更精准的实验方法告诉我 因为目前为止，同样的sample同样的condition却会出现前一次有东西後一次没东西 表示非常不稳定，所以我没办法藉由比如 45c --> 没band 44c --> 有band 43c --> 有band 来推测 44度c或许是该值 ps:现在实验情况是 比如 45c ----> 第一次 没band ------>第2次 有band ------> ..... 44c ----> 第一次 没band ------>第2次 有band ------> ..... 43c ----> 第一次 没band ------>第2次 有band ------> ..... ..... ... .. 而实验组condition刚好落在中间 以目前比较合理的猜测即是TM值太低 加上PRIMER专一性低 即是Ia大讲的部份 所以我才想要找出那个值，或是该问题 ※ 编辑: travelmat 来自: 59.126.67.149 (02/22 17:07) 补充一下 我的想法是这样 今天比较合理的假设就是不专一 (TM值太低；PRIMER专一性不够；....等等) 但我要先有东西证明 的确今天是因为这样问题才会有BAND 而不是其他我没注意 或是我没办法排除的因素造成这个东西出现 这样我才有办法在实验中把这项污染去掉 感谢 ※ 编辑: travelmat 来自: 59.126.67.149 (02/22 17:11) 上面有提到 有单只跑 DNA+水 跟 单只 水 这两组 而这两组都没事 我同一次操作 一次做两组 (同样东西) 分两次pcr 同台机器，而且听从同学意见，连pcr机里放的well都一样 前次跟後次就是不一样 如果是ez buff dna water .... 等等污染的话 应该没道理 同样实验同样操作 前次有污染，後面却没污染 ※ 编辑: travelmat 来自: 114.33.54.112 (02/23 00:04) 感谢上面各位大大 帮我想办法 小弟在这边先谢过 万分感谢 ※ 编辑: travelmat 来自: 114.33.54.112 (02/23 00:07) 做这目的应该是 1.污染来自dna ---->则用水取代dna时 就不会有band出现 (当然前题是我要先确定此dna跟PRIMER的确是不MATCH的，同时还需 另一组乾净dna做check) 2.污染来自水 ----> 则用水取代dna 却还是有band出现 我上面有提到我有做一组 dna+水 下去跑pcr当control ------> 没band出现 所以有可能为: 1.水跟dna没污染 2.或是有污染但因为没ez，primer...等等把他放大 接着看我平常实验的CONTROL dna+water+ez+primer.....等等 却会有前次有污染，後次却没污染的情况 所以会变成为 1.如果是 这些内容有污染，在每次都有混匀的情况下取样，应该结果都是一样 要马都污染，要马都没污染 (我知道如果直接跑一管以水取代DNA，仍加PRINER，EZ会比较直观 但就现有资讯应该也可以得证 ?) 交叉污染的意思是比如a管dna污染到b管dna吗? 可现在CONTROL组跑出的BAND大小跟实验组不太一样 差了约200bp 而且主要在於污染应该是不可逆的 也就是污染了就污染了 (除非他degray) 这样就无法解释 为甚麽同样实验 多次实验下来 前後结果会不一样 另外想请问HEK大大 你提到 "用non-targeted DNA做NC太容易有意外。" 因为小弟实验目前是这样 有组DNA叫 RV 我将这DNA拿去做bisuilfite处理 (DNA序列上的 C会转变为T (U)， 但如果这C上有被甲基化，则依然保持C) 暂称 RV(B) 因应序列前後的改变 ( RV----->RV(B) ) 我设计了一组 "序列改变後"的primer 也就是理论上他只会和 bisulfite处理过後的DNA进行binding RV(B) 此时我设计了两组control pos+ control: 利用另外一组PCR primer从RV上P出一段DNA 因应PCR product "不会" 有甲基化的情况 因此把这段P出来的DNA进行bisulfite处理 则此DNA序列上的C 必然 会转变为 T(U) (此处排除转变不完全因素，有别组control来排除这因素) (PS 这边使用的PRIMER和实验组 primer不同，这边的primer match的是 非bisulfite的序列，单纯用来做出一段没有甲基化，且包括我感兴趣片段的 DNA片段) 所以利用这组当POS control 也就是假设我的实验组中 的确有这片段，同时处理bisulfite成功，则band size应该会和 +control一样 (确认DNA中是否有这片段还有另一步骤duoble check bisulfite处理成功 也还有另一步骤duoble check) NEG- control: 拿原始RV DNA做为control 也就是处理bisulfite使他序列改变"前"的DNA 因应primer设计是以 "处理过後" 的DNA序列 = RV(B) 因此RV理论上是不可能被binding 目前我是这样设计的 但HEK大大提到的我刚刚有想了一下 的确non-target negative control有很多问题 我自己想到的有这些 1.没BAND不一定就等於 他不会bind 2.-control 有BAND也不代表 实验组的BAND是错的 想请问HEK大大有没有比较好的方法可以提供给小弟 万分感谢 也非常谢谢其他大大 真的非常感谢 ※ 编辑: travelmat 来自: 140.120.130.105 (02/23 13:44) ※ 编辑: travelmat 来自: 140.120.130.105 (02/23 13:47) ※ 编辑: travelmat 来自: 140.120.130.105 (02/23 13:54) 谢谢楼上各位 我决定重头再一次把SMAPLE ，水...等等全部check一次 (其实已经check过两次了= =) 先排除污染 如果不行的话接着在考虑 non-target control 这部份 @ace大 很不幸的这步只是我实验的第二步.... 後面还有更麻烦的>"< 当初有考量到两段序列 (即处理前跟处理後的序列) 非常相近 即使bind的位置有特别选过，但又加上tm值问题 会出现这情况似乎也是可预期的 但目前实在想不到其他方法可以替代 加上自己实验室跟周围实验室没人用类似方法做此类实验 无从问起 paper在这部份又会忽略 加上现在paper都用kit做这种实验= = 所以只能自己一步一步try 真的非常感谢各位大大 祝各位实验顺利 :) ※ 编辑: travelmat 来自: 114.33.54.112 (02/25 10:50)