作者GanLinBa (Fait votre père)
看板Biotech
标题[求救] transfection efficiency (Huh-7)
时间Wed Jan 11 02:28:24 2012
不管怎做都只接近50%
但希望能更高一点 能达到70%
我的方法:
3cm dish 5*10^5/3 ml growth medium
1. opti(92 ul) + lipofectamin 2000 (8 ul), RT 5 mins => A eppendrof
2. add opti (97 ul) + EGFP (3 ul) into A eppendrof, RT 20 mins => B eppendrof
(total volume = 200 ul)
3. remove medium and wash for dish
4. add 800 ul into B eppendrof => C eppendrof (dilute toxicity)
(total volume = 1 ml )
5. add 2 ml growth medium and C eppendrof into 3cm dish
4. incubate 24 hrs
因为Huh-7很难transfect 所以才用24小时(48小时我也试过)
而不是opti transfect 6hrs後把opti含有lipo倒掉再换growth medium
(我曾经试过 但因为换growth medium 而细胞会继续长)
但是理论上GFP应该算蛮简单吃进去
请问我哪里步骤需要更改会比较好
但我去算时大约都才接近50%
还是要只用opti transfect 6小时後 不要倒掉再加growth medium会比较好?
感谢
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爥
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◆ From: 115.43.213.75
※ 编辑: GanLinBa 来自: 115.43.213.75 (01/11 02:30)
※ 编辑: GanLinBa 来自: 115.43.213.75 (01/11 02:38)
1F：推 vancent:电的考虑吗? 01/11 12:53
2F：推 arlix:DNA的浓度? 01/11 20:50
3F：→ GanLinBa:电的可能不考虑 DNA 1060 ng/ul 01/11 22:54
4F：→ xenosdk:换一个transfection reagent试试看? fugene 6/fugeneHD 01/18 04:11
5F：→ xenosdk:还有就是如果你细胞能长时间承受serum starvatio 01/18 04:12
6F：→ xenosdk:serum starvation*, 就不要加growth medium,直接incubate 01/18 04:13
7F：→ xenosdk:24h, 或是加少量serum的medium.. 或是加2ml opt/w x%serum 01/18 04:15