※ 引述《FireHell (冥煌 = 好硬)》之铭言： : 标题: Re: [求救] MTT assay 处理组数值高於控制组 : 时间: Thu Dec 29 21:11:44 2011 : : ※ 引述《unwell ( )》之铭言： : : 已经爬过文了没看过有人问 : : 请教板友 : : 我做的试验是在caco-2贴附後 加入某药品进行攻毒 : : 另外添加两个菌数的某菌 : : 想看该菌可否使药品对caco-2的伤害降低 : : 结果 : : control是没加药品也没加菌 OD值平均视为100% : : 只加药品组OD值是控制组的80% (嗯 还OK) : : 重点来了 : : 只加低菌数某菌组OD值居然是control的200%!! : : 我想说 会不会是caco-2跟菌之间有吸附的关系 所以测MTT时也同时测到菌了 : : 但在只加高菌数某菌组OD值是control的120% : : 而在药品与菌共同treat下则都低於100% : : 呜哇我该如何解释 : : MTT assay结果 实验组比control还高呢? : : 甚至达到200%??? : : 补充 : : 1. 96-well 细胞数: 2x10^4/well 100 μl/well : : 2. 因为有菌的处理 反应时间设定只有12h : : 3. 在加入MTT之前 有用200 μl PBS wash 2次 : : 4. triplicate, standard error挺小的 : : 谢谢各位了~~~ : : ※ 编辑: unwell 来自: 140.112.154.104 (12/29 17:17) : : 推 FireHell:加入MTT之前不可以用PBS wash，会把酵素洗掉 12/29 17:47 : : → FireHell:很多人会犯这个错误 12/29 17:47 : : → unwell:MTT是加在medium里处理细胞反应4h 不是测那4h产的酵素? 12/29 18:25 : : 3-4 h是MTT跟succinate dehydrogenase完全反应所需的时间， : 不是为了让细胞产生酵素的时间。 : 当然这段时间细胞也会产酵素，但量少。 : : : → unwell:如果会洗掉酵素 那吸掉medium那步时不就也吸掉酵素了??? 12/29 18:29 : : → unwell:谢谢大家的回应 12/29 18:29 : : 推 icome:要测的dehydrogenase在mitochondria 不会被洗掉 12/29 18:40 : : 不多说看paper吧(可惜是残体的)： : http://wenku.baidu.com/view/b290102fed630b1c59eeb578.html?from=related : : 缓慢吸掉的medium与medium对照组无显着差异，所以不会吸掉很多酵素。 : 但是PBS洗一次吸光值降低80%；洗两次降低98%。 : 再不相信就自己实验看看有洗跟没洗的差异吧， : 我自己就试过了，吸光值会差非常的多！ : 如果吸光值太低，即使都是跟control比，data仍会有很大的系统误差。 : : -- :

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) : ◆ From: 140.112.218.89 : 推 aceliang:我实在看不太懂这篇文章...就表11而言，将样品混匀是要？ 12/29 22:09 : → aceliang:既然细胞表面的SDH被洗起，那为什麽上清液组没有formazan 12/29 22:10 : → aceliang:又如果细胞表面沾满了SDH，那MTT本身的意义势必得打折了 12/29 22:11 : → aceliang:大概是我慧根不足吧XDDD 12/29 22:12 : → FireHell:跟楼上有过一样的疑问，这篇很多地方说的不清楚　　　　 12/29 22:38 : → FireHell:所以我就自己去试了，有洗两次比都没洗的吸光值下降了0.4 12/29 22:40 : → FireHell:原因的部份我也是对作者的推论存疑 12/29 22:46 : → a001ou:你提供的文献反而表示要洗两次 如此可有效降低培养基中 12/29 22:53 : → a001ou:SDH的量 12/29 22:55 : → FireHell:楼上您看的跟我看的是同一篇吗？ orz 12/29 23:01 : → a001ou:楼上要不要先了解MTT原理再来? MTT是测细胞"内"粒线体呼吸 12/29 23:30 : → a001ou:链活性 今天你说wash会导致MTT结果减弱 那表示包外充满会 12/29 23:31 : → a001ou:造成MTT形成紫色结晶的物质(不论是酵素还是化学物质) 那就 12/29 23:32 : → a001ou:表示若不wash 那MTT结晶几乎都是包外物质造成的 如此将严重 12/29 23:33 : → a001ou:影响MTT所要观察的粒线体活性 why？因为wash不会洗到胞"内" 12/29 23:35 : → a001ou:的粒线体 12/29 23:35 : 楼上讲话很呛喔，MTT原理我还要你教？ : 你有看到paper的结论5吗？所以三位作者都不懂MTT原理呢！introduction写假的？ : 你要不要先了解MTT的目的再来？主要是测prolifiration耶！ : 哪篇教科书限定胞内粒线体上的SDH才能是指标，其它的SDH也是细胞分泌的就不算？ : 可以麻烦您找给我吗？ : 况且你又如何确定wash时胞内的SDH不会释出？你就这麽肯定？文献呢？ : 你可以多去打听其它实验室或其它学校怎麽做，加MTT前不wash的一堆好吗？ 小弟不才 在此发表一些个人浅见 F大提供的这篇paper中 第109-110页提到下列两点: 1.琥珀酸脱氢脢(succinate dehydrogenase, SDH)是细胞生长代谢产物 2.琥珀酸脱氢脢会分泌到细胞外 并附着在细胞膜上 作者对於这段论述并没有提供参考文献 为此 我自己查了一下生化课本 发现SDH是存在粒线体内膜 在电子传递链的作用中 扮演着重要的角色 似乎并不能算是一种代谢产物(?) 另外 为何在粒线体内膜的酵素会分泌到细胞外? 印象中在细胞凋亡时 粒线体膜的结构破裂 才会让其中的蛋白质被释放至细胞质中 假如正如作者所言 SDH会附着在细胞膜上 那其功能又为何? 生理功能又会是甚麽? 而SDH在细胞内又是甚麽反应的代谢产物呢? 另外 回到原po的问题 在您的实验设计中 MTT assay可能不是一个适合的方法 因为多数细菌也会表现SDH 而用MTT assay控恐怕无法分辨 所测量到的SDH活性 究竟是来自caco-2或是细菌 或许您可以改用死菌来做实验 就不会有上述的问题 亦或是利用其他的研究方法 如板友推文提到的 PI染色 小弟不才 在论述中有错误的地方 还请各位先进指教 : 推 icome:可能是细胞凋亡释放出来的 找不到SDH会被释放的文献 12/30 00:19 : → blence:MTT不只用来测proliferation,NADH-NAD pool测量也能用 12/30 00:44 : → soom:请板友讨论时避免情绪性言词 12/30 09:44 : 推 unwell:谢谢原PO的回应 但是我wash了两次 是为了把菌尽量wash乾净 12/30 11:41 : 推 unwell:而且即使wash了两次最後OD值都很高 甚至扣掉blank後还 >1 12/30 11:47 : → unwell:>1会不呈线性 我会再调整 不过我还是想问 有没有可能这个菌 12/30 11:48 : → unwell:会刺激粒线体里酵素的表现 如果是 那其他做药物处理测MTT的 12/30 11:50 : → unwell:试验不就都可能得考虑会不会刺激酵素的表现而结果误差很大 12/30 11:51 : → FireHell:回楼上原原PO，OD值高是因为您种的浓，如果真的有wash必 12/30 13:15 : → FireHell:要，您又考量SDH遭受菌或药物影响，可以考虑改用PI stain 12/30 13:16 : → FireHell:作为您测存活率的方法 12/30 13:16 : → FireHell:MTT assay作为viability确实有其前提，像饥饿(serum free 12/30 13:28 : → FireHell:的环境下就可能会因autophagy降低SDH的量，值得注意 12/30 13:29 : → FireHell:又比如说在complete medium环境下以autophagy inhibitor 12/30 15:46 : → FireHell:(3-MA, CQ) treat细胞，会得到>100%的结果 12/30 15:47 : ※ 编辑: FireHell 来自: 140.112.98.115 (12/30 15:47) : → a001ou:那你要不要解释一下你的推文 什麽叫做很多人犯的错误 加 12/31 00:11 : → a001ou:MTT前不该wash？ 完全是误导别人 还怪别人呛? 12/31 00:11 : → a001ou:有多少protocol跟原理说明wash不影响MTT 你却任意引用一篇 12/31 00:12 : → a001ou:说得不清不楚的文献却用肯定的语气来支持这充满问题的结果 12/31 00:13 : → a001ou:你真的觉得这样误导别人是正确的? 12/31 00:14 : → a001ou:还是说你有很好得证据支持你说wash"可以"有效抑制粒线体活 12/31 00:16 : → a001ou:性 导致MTT结果失准? 毫无证据的乱说 我这态度刚好而已 12/31 00:17 : 推 martyrtitan:楼上 原PO不就有尝试过了? 12/31 00:59 : → martyrtitan:版主都说避免情绪用词了 这麽呛有必要嘛 12/31 01:00 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 118.168.87.197 ※ 编辑: APPswe 来自: 118.168.87.197 (12/31 16:35) ※ 编辑: APPswe 来自: 118.168.87.197 (12/31 16:35)