作者jihher (jihher)
看板Biotech
标题[求救] RNA 的 纯度太低 (大概1.0而已)
时间Fri Dec 23 13:03:34 2011
大家好,
最近我第一次做RNA Extraction准备做real-time qPCR, 我用TRIzol的方法, 但是取出来
的RNA纯度 0.9-1.0而已
我的方法是如下
细胞数 10^4 - 10^5 cells
1. 加 1ml Trizol , 室温静置5分钟
2. 12,000 xg, 10min, 4'C, 抽上清液去新的tube
3. 加 0.2ml Chloroform, 用手摇晃15s, 室温静置3分钟
4. 12,000 xg, 15min, 4'C, 抽分层後的上清液大约有600ul, 我取~400ul去新的tube
5. 加 0.5ml Isopropanol, 室温静置10分钟
6. 12,000 xg, 10min, 4'C
7. 上清液倒掉, 留下白色的pellet
8. 加 1ml 75% EtOH, vortex 10s
9. 7,500 xg, 5min, 4'C, 上清液倒掉剩下大约20-30ul, laminar flow风乾10min
10. 加入20ul 的 RNase Free H2O 形成RNA原液, 55'C静置10分钟, 保存在-80'C
11. RNA原液抽部分稀释100X & 10X, 去看吸光值A260/A280
问题是 A260/A280 = 0.9-1.0 , 我全程在laminar flow进行
不知道是不是细胞数太少的原因 还是中间过程漏了甚麽重要的步骤 ??
谢谢大家 !!!
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.51.248
1F：推 dodomilk:我没有作步骤2.但我想应该不会有差 12/23 13:22
2F：→ dodomilk:为什麽要作步骤11.呢？ 这样浓度不是变超低吗？ 12/23 13:23
3F：→ dodomilk:每ul应该只剩不到100ng吧？ 12/23 13:23
4F：→ saviora:第4步没吸到白色的东西吧 12/23 13:49
没, 因为我才抽2/3的上清液
5F：→ saviora:第11步应该不是全部拿去稀释 12/23 13:49
※ 编辑: jihher 来自: 140.114.51.248 (12/23 14:09)
6F：推 icome:不是吸到蛋白就是酒精残留 这数值蛮夸张的 12/23 14:13
7F：→ icome:那你吸光值多高 浓度太低数值太低根本不可信 12/23 14:14
稀释100x的OD值回约0.04左右, 所以原液再取一些稀释10X的OD有0.2
但是 比例还是一样, 酒精是用倒的还是用吸的? 残留影响那麽大?
厂商是觉得我细胞数太少
※ 编辑: jihher 来自: 140.114.51.248 (12/23 14:25)
8F：→ f9361046:我没做2和11 12/23 21:10
9F：推 icome:换算一下你的RNA浓度只有160ng/ul... 细胞种多一点吧 12/23 21:12
10F：推 icome:细胞数至少提高十倍 一般抽出来都有1-2ug/ul的浓度 12/23 21:16
11F：→ huuban:是什麽物种的细胞？有没有跑胶图？ 12/23 23:59
12F：→ datro:第二步的目的是? 我从来没做过第二步 直接加1/5氯仿 混匀离 12/24 00:44
我的是生医材料, 第2步是为了把材料去掉
13F：→ datro:心 第二步应该是 phenol/choloform的步骤吧 12/24 00:45
感谢大家 !! 後来是OK了
不过有一组RATIO是2.16, 这样还是可以跑qPCR吗?
※ 编辑: jihher 来自: 140.114.202.191 (12/24 01:15)
14F：→ huuban:所以後来是怎麽解决的呢？ 12/24 22:42
15F：→ keepseaching:260/280的比值低应该是RNA有降解的现象 12/25 01:05
16F：→ keepseaching:不过有时吸光值只是参考 最好跑个胶检测看看 12/25 01:07
17F：推 icome:超过2可能有降解 跑胶看看 12/26 11:22