一直卡在这步 先简单讲一下我的实验 我外插一段dna片段进入活体geomic 然後从活体中取下该部位组织，并且抽其genomic 之後利用BISULFITE的方式检测这段我所外插的的这段序列在活体环境中 甲基化的情况 我现在遇到比较大的问题有3个 1. CONTROL如果做? 意思是，我今天把从组织中抽出来的genomic做bisulfite後 我PCR不管有无band都需要一个 + control来做对照，才有办法分析结果 我目前想到的方法是: 利用另一组primer落在我bisulfite primer之外，用其去PCR还未bisulfite之前的 GENOMIC，利用PCR product不会甲基化的特性，在将这段product拿去做bisulfite 最後利用bisulfite的primer进行PCR这段product以做为我的control 不知这方法有无利弊? 2. bisulfite的成功度? 因为我是用非kit的方式下去进行这反应，难免需要考虑到转换的成功度 也就是可能整段只有60%转变，90%转变 我要如何确定我这次处理後的结果，是足以可信的? 目前想到方法有两种 一就直接定序，理论上含有C只有两种情况，一是CG site的C有甲基化 因此他依然为C 另一种则为非CG site依然还是C，则考虑他是为bisulfite不成功 (没C上没甲基化则应当会变为U) 不知这边逻辑上有无错误? 不过因为不可能每次处理都送定序 因此就用类似想法，下去做另一种测试 直接用举例 假设有一段序列 简短 如下 TEST primer CG GGATA <----以非处理过bisulfite的genomic为模板 Genomic GC CCTAT <----尚未处理bisulfite的genimic bisulfite G U UU <----处理bisulfite後的genomic ^ ^^ | |---- 这两个位置应该会转成U (因为不被甲基化) | |_____ 这个位置可能变，也可能不变 利用类似想法下去看primer有无bind上，来测成功度 但缺点就是，只重点在primer末6码有无bind上 也就是只能看这6码的情况，所以代表性还是有差 (但至少是个简单的辨别方法) 不知这逻辑上是可行吗? 或是有无更好的方法? 3. 有无能提供bisulfite的protocol? 过程中都无用到KIT的 (包含clean kit) 因为我们LAB只有我在做 其他人实验跟这方面完全不相关 所以无从问起 问其他LAB多用zymo的methylation kit 有借来试过，老师觉得效果不好，因此选用传统非KIT方式做 目前自己上网有找了一些，多是其中某步需要KIT(CLEAN KIT) 依老师意思是，最早以前都只用酒精沉淀 因此我就研究了一下步骤 如去盐类，沉淀，去亚硫基...等等 大至上是有造特定一份protocol,但小处有改这样 但因为这种东西很怕差一点点差很多，尤其protocol混用 怕因此影响结果 (如前後比例问题) 所以才来求protocol 以上三个问题，望各为大大救救小弟我 我在这边卡非常非常非常久了 在此先感谢各位大大了。 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.130.105 就.......... 问过反应是都不错啦... 老师的考量可能除了效果以外还有价钱吧..... >"< ※ 编辑: travelmat 来自: 140.120.130.105 (12/21 14:14)