※ 引述《premire (热腾腾的泡面)》之铭言： : 原文恕删 : 参考了sephadex产品说明书 其中一段如下： : Use 0.15 M NaCl or a buffer with equivalent ionic strength to avoid pH : dependent nonionic interactions with the matrix. At very low ionic strength, : the presence of a small number of negatively charged groups may cause : retardation of basic proteins and exclusion of acidic proteins. : 根据以上我的解读是column的metrix是dextran, 带有负电荷OH group,在极低的离子强度 : 假如sample带有正负电荷都会和metrix产生吸附或是排斥现象.因此必须要使用0.15M盐类 : 增加buffer的离子强度,减少sample与metrix的交互作用. : 另外有提到 : When working with a new sample, try these conditions first: 0.05 M sodium : phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.0 or select the buffer into which the product should be : eluted for the next step (e.g., further purification, analysis, or storage.) : 意即使用时建议先试试看0.05M sodium phosphate + 0.15 M NaCl : 问题来了！之前使用的buffer组成为D-PBS,本身缓冲浓度Sodium Phosphate Dibasic : 8.10 mM, Potassium Phosphate Monobasic 1.47 mM, Sodium Chloride 138 mM : 分离结果是看不到後面的小分子elute out : 问题1:若改为说明书建议的配方, NaCl浓度没差多少,而是差在缓冲溶液的浓度(50 mM)会不会 : 对於我的分离结果会有改善呢 : 问题2:我的大分子是SOD,在pH 7.4环境下应该不会带特定电荷, 还需要这麽高（0.15M） : 盐类吗？ : 由於sample快没了 每一次的使用都尽量力求效率 请有经验的大大指教！！！ 目前用的sephadex G-25 体积是5 ml,现在我利用UV 220 可以观察到大分子和小分子 大约分别在1.5～2.0 ml可以收集到大分子蛋白, 小分子GSH大约在3.0 ml附近可以收集到 然而为了分析蛋白质的纯度,我也把小分子GSH标准品打入column去测UV 220, 并以专一测 定法测量上述1.5~2.0 ml所收集到的fraction, 结果发现这些fraction都有少许的GSH 讯号,检讨实验手法如下： (1)过滤采用针筒手动,流速大约控制在 1～2 ml/min,是在handbook的建议范围内 (2)样品体积是100 μl,直接以pipet打入column後用针筒注入buffer过滤（我看handbook 有说假如样品不足1.5 ml(Void volume)的话会把体积补到1.5 ml後再打入column) 但是由於小分子的分子量仅400不到,一个5 ml的column大约在2 ml就收集到,这让我怀疑 这支column的分离效率 由於蛋白质的纯度对我的研究而言相当重要,原则上不希望在前述的fraction（2 ml之前） 出现。目前怀疑是(2)造成的问题。由於这支column也没用多久,不想因为这样就换另外 一支,不知版友们有没有做过类似实验可以作经验分享,小弟感激不尽!!! --

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