作者bigpobatin (pobatin)
看板Biotech
标题[求救]为何都测蛋白质浓度了,跑出的western band
时间Thu Dec 15 16:54:44 2011
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
实验为测定核质分离的蛋白质浓度(细胞实验),但每次测完蛋白质浓度,western跑完胶後,理当不同时间点未加药之控制组的核内蛋白表现量应该一致,可每批细胞跑出来的表现量却是不一致,internal control则和目标蛋白表现量的趋势是一样的,其也会受影响,
但没有细胞质蛋白的污染.不知道未什摸会这样
以方便板友帮您追踪问题
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◆ From: 163.15.163.67
1F：推 martyrtitan:重新定量一批吧 有可能是定量出错了 12/15 17:49
2F：→ martyrtitan:你的意思是internal control也会随着给药而有变化? 12/15 17:49
3F：→ martyrtitan:你用的internal是 ? 12/15 17:50
4F：推 mesenchymal:我猜是histone H1 12/15 18:33
5F：→ mesenchymal:原PO的意思应该是希望不加药的细胞不同时间点 12/15 18:35
6F：→ mesenchymal:internal control 做出来要一样? 测浓度的方式是? 12/15 18:36
7F：推 leoblack:测蛋白质浓度本来就是参考~另外搞不好药本身对internal 12/15 19:14
8F：→ leoblack:control就有影响 12/15 19:14
9F：推 supray:sample够 也舍得花的话 个人觉得先跑一次Normalize再跑一次 12/15 19:59
10F：→ supray:比较准-..- 12/15 20:00
11F：→ bigpobatin:用BCA测定, 核内intrnal用过laminB, actin但都会受药影 12/15 21:00
12F：→ bigpobatin:收了很多次没有加药的控制组,於不时间点的蛋白 12/15 21:05
13F：→ bigpobatin:但每一次测到的结果都不同,蛋白浓度测定也都准阿 12/15 21:07
14F：→ bigpobatin:理论上控制组於不同时间下目标蛋白的表现量应该是一致 12/15 21:08
15F：→ supray:破核的detergent有没有超过BCA的容许浓度? 12/15 22:59
16F：→ yuasa:load胶load的不准?定完量稀释得不好?先看看药对internal 12/16 00:11
17F：→ yuasa:control的影响有没有浓度相关性来决定是否是人为疏失造成的 12/16 00:12
18F：→ bigpobatin:DTT算变性剂吗? 主要是利用盐离子浓度破细胞 12/16 11:57
19F：→ bigpobatin:同一批样品重复跑出来的结果是一致的,所以应该不是load 12/16 11:58
20F：→ bigpobatin:不同次收的sample,跑出来的结果都不一样 12/16 12:00
21F：→ bigpobatin:其实不只是internal, 而是那整条lane的蛋白量都变少 12/16 12:02
22F：→ bigpobatin:因为transfer完,会用Ponceau S染膜 12/16 12:02
23F：→ bigpobatin:很明显那整条lane蛋白都变少 12/16 12:03
24F：推 lyu0001:要注意蛋白质浓度的侦测上限以及用BSA做标准曲线。 12/16 13:15
25F：→ martyrtitan:我是用组织 会稀释50x 且用lysis buffer当sample的blk 12/16 13:18
26F：推 lyu0001:或是蛋白质transfer不完全 12/16 13:18