作者lier1986 (紫)
看板Biotech
标题请问大家ligation时ligase使用的量
时间Fri Dec 9 20:41:06 2011
前情题要
我在11月底有发了文想询问cloning的相关事宜
那我目前的进展是
1.所有想要clone的gene，经PCR後，已经接到pGM-T上了。
(pGM-T是跟基隆米克斯买的，听说是陆制的次等货= ="；非invitrogen的pGEM-T)
2. competent cell的问题已经解决。
我自己做的competent cell转型效率大概是10^5~10^6左右
现在是打算把pGM-T里面的insert给切下，然後接到pET20b上
使用的RE为NdeI & HindIII
但是做了两三次一直接不上去
RE的切割应该是没问题的
我回头去看其他人ligation的protocol
好像使用ligase的量都不太一样
所以想问问各位 如果你们家用的ligase是NEB的
大概ligase的量都加多少呢?
(我看了一下NEB ligase的产品说明...
我好像每次做都加入400U的ligase 不知道这样会不会太多= ="
我看TA cloning kit做ligation时 一次也才加3U的ligase...)
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.122.198.1
1F：推 dodomilk:两个U是不一样的 400 CELU (NEB) = 6 weiss units (别家) 12/09 21:22
2F：→ dodomilk:我用NEB也是都做不出来 你可以试试看TA时用的ligase 12/09 21:22
3F：→ dodomilk:我们家是用Fermentas的ligase啦，便宜又好用 12/09 21:24
4F：推 puromycin:常见的0.5ul;少见的1ul﹐连到T上可以先测序看看有无问题 12/09 21:58
5F：推 joseph103331:ligase应该是有就行 要不要考虑vector跟insert都切胶 12/10 02:52
6F：→ joseph103331:纯化? 这样才能保证酵素切割都没问题 还是已经做了XD 12/10 02:52
7F：推 lyu0001:是没有长菌吗？ 12/10 16:58
8F：推 cji4cjp6:我实验都加o.5ul TA用的+1 12/11 00:01