各位板友大家好，小弟并不是生科本科系的学生， 目前正好碰到一些困扰，希望板上的各位能够给予一些方向与建议，十分感谢! 小弟目前正在试图突变自己实验室所分离菌株(非E. coli)之某个功能性基因， 所使用的方法依照paper上所提到的方式是以送入plasmid做double crossover之交换， 使chromosomal DNA上的该片段产生一段inframe deletion(序列codon有调整过， 可做出有功能之蛋白质。) 为了达成这个目标，小弟先从NCBI上找到同属同种菌株的genomic DNA序列， 接着从中得到目标基因的保守性区域後设计primers，是有成功得到所需要的基因片段， 不过後来从此菌株的细胞调控得知，该基因会同时受到两种机制去影响其表现， 所以就算突变了chromosomal DNA上的片段，此片段也会受到另一个机制影响而不表现， 使得小弟想要测试之突变蛋白无法正常合成。 有鉴於可能出现这种情况，目前想要以送入overexpression之plasmid替代chromosome， 於chromosome转录受到抑制时仍可合成该突变蛋白。 不过现在出现几个观念上的问题， (1)想请问大家一下，送入plasmid的时候要怎麽样控制该plasmid是要double crossover， 还是要做over-expression？送进去要做over-expression之plasmid是否会跑去形成 double crossover而消失？ (2)想请问如果要做over-expression之plasmid，是不是一定要先调出目标基因的全长？ 若要调出全长，目前从NCBI资料库上是可以稍微设计出最靠近5'end和3'end的primer， 但是此PCR primers在设计软体上所模拟的效果并不好，Tm差距有点大，3'end的 primer也有出现hairpin loop的可能性，小弟想了另外几个方案，一个是先用inverse PCR找出5'end和3'end的上下游基因序列，在设计较好的primers得到目标基因全长， 而从中又延伸出一个疑问，从目标基因延伸出的5'end与3'end多余序列是否会影响 over-expression的蛋白质表现？另一个方案则是抽取mRNA进行RT-PCR得到该基因的 cDNA，但要如何选中目标基因的mRNA？进而进行RT-PCR呢？ 上述这些大概就是小弟全部能挤出来的想法了，还希望各位能够把我错误观念的地方提点 一下，也希望各位能给小弟一些额外的建议，让小弟能够克服这个困难。十分感谢!!!! --

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