作者eyest (李察狄恩安德森)
看板Biotech
标题[求救] western压片全黑
时间Fri Oct 28 10:45:27 2011
各位版友们好
上个月做实验都还顺手，自从这个月出去玩了几天回来
甚麽都变了...最糟糕的就是western镜然压不出东西
想请教各位，请帮我指点迷津
我的蛋白是从细胞收下的用RIPA buffer 定量30ug
1. 跑电泳90v 30min, 100v-110v跑到结束，
2. transfer 100v 90min
3. 10% milk blocking 1H
4. 1抗 1:500 O/N
5. TBST wash 3/10min
6. 2抗1:7000 1H
7. TBST wash 4/10min
8. ECL(P开头那家的) 1min
9. 压片3min 洗出来黑嘛嘛的
我要的位置再160kDa左右，但是什麽也没有
之前一模一样的条件有做出来阿
positive control压的出来阿
有问题的压片网址
http://ppt.cc/nb9n
想请教各位我的问题出在哪阿??谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.20.152.215
1F：推 robertkoch:有没有先压actin看看?用的是PVDF ? NC ? 10/28 14:45
2F：→ eyest:PVDF，我的是total p38a有压出来 10/28 15:07
3F：→ even2300471:一抗一直加这麽多? 洗出来太黑应该是讯号太强 10/28 17:16
4F：→ even2300471:或是压片时间短一点试试看? 10/28 17:17
5F：→ eyest:我有试过压1min or 几秒，但是都没东西连band都没阿！ 10/28 18:29
6F：→ Realthugz:前後的材料步骤有没有差异? @@ 你有压不同protein比较吗 10/28 21:35
7F：→ Realthugz:就一楼建议的那样 要找问题可不是一个control可打发的 10/28 21:37
8F：推 robertkoch:同一张PVDF跑完transfer剪三段分别1抗1:500;1:1000 10/28 22:22
9F：→ robertkoch:1:2000 去试 10/28 22:25
10F：→ robertkoch:TBST的配方有对吗? pH值有对吗? 偏硷会有如stripping 10/28 22:26
11F：→ robertkoch:Block buffer 改 5%milk 10/28 22:29
12F：→ robertkoch:总之试着一项一项去除错,之後你就会很有心得的 10/28 22:31
13F：推 kingtiger:transfer的效率可能要确认,100V 90min可能不一定会过 10/29 08:26
14F：→ kingtiger:出一抗wash次数不足,洗个6-8次/10min,二抗也是 10/29 08:27
15F：推 icome:好浓的牛奶... 二抗可以更低 一比一万甚至两万就好 10/29 13:06
16F：→ eyest:谢谢大家的意见，我会来试试看 10/29 15:51
17F：→ popopig2000:membrane的尺寸对吗? 10/30 15:42
18F：→ eyest:因为是跟以往一样的条件，尺寸没有错误 10/31 00:06
19F：推 warmheaven:2抗浓度可以调到一比一万 10/31 16:41
20F：→ cin:ECL有换过吗? 是不是太强了? 10/31 20:03
21F：→ eyest:ECL跟以前一样1:1耶。楼上2抗意见收到～谢谢大家 10/31 21:30
22F：推 tchan:之前类似经验是牛奶坏掉，重配试试看!!一抗也可能坏，加高浓 11/01 19:21
23F：→ tchan:度再试试看，感觉跟transfer以前无关，不然marker也会有问题 11/01 19:21
24F：推 vickyabcd:blocking问题? 11/02 11:05