以下为个人经验.. ※ 引述《JaShih (Sharon)》之铭言： : 最近做western blot一直做不出来，做得很挫折 T^T : 虽然之前也在板上爬过不少有关western blot的文 : 也试过不少方法 : 不过每次压出来还是一片白..... : 希望版上大家可以帮我看看我的步骤上有没有哪边需要改的 : 谢谢大家 <(_ _)> : --------------------以上是前言分隔线XD----------------------------------- : 我要跑的蛋白质主要分子量分布为40-180kDa : separating gel用12% 如果要看到130以上有东西要分开最好是用6%gel : transfer membrane 是PVDF 我们家是用NC menbrane 可以少个methanal活化的步骤 也很好transfer 缺点是太贪便宜常常会拿到coating不匀的产品 : transfer步骤: : 1.transfer 16V 1hr 4℃ 我们家固定先用350mA 120mins下去try 看结果再判断要不要调condition : 2.blocking 1hr (5% non-fat milk in PBS) 听说安佳很好用 : 3.一抗 4℃ O/N (稀释1:1000-1:5000，主要以说明书为主) : 4.wash 10 min x 3次 : 5.二抗 RT 1hr (稀释1:1000-1:5000，主要以说明书为主) : 6.同4 : 7.ECL作用数秒~3min後压片 要看你的protein好不好压挑不同的ECL有不同的作用时间 pico:2min plus:1min femto:5min : 二抗的部分有洗过1hr.2hr.3hr : 但是都没有压出来 : 压片的问题大部分是压不出来 : 不过也有遇过几次黑片的状况 : 抗体厂牌... : 一抗大部分是R&D system，少部分是santa cruz : 二抗是santa cruz (之前爬文santa的抗体好像有点 恩...Orz) 我家老板是不喜欢santa都放4度 但是santa便宜 挑到某些产品还是很好用的 : 另外，想顺便问一下 : Ponceau S有没有哪一家比较便宜阿... : 之前问sigma的好贵又好大罐 = = " : 谢谢大家 >"< 我的习惯是会前後各load一条marker 直接判断大小对着裁 除非有特殊原因不然不太喜欢染那个 通常看不到band 1.protein本身不好做 2.western condition不适合 建议跟推文一样看看b-actin等internal的成色怎样再说 -- --

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