提供一点经验分享罗.. 之前有碰过类似的问题 我们家处理的是植物样本 TRIzol、RNAzol是完全不能抽的状态... (买了一瓶TRIzol放在那里没人用..有人想拿东西来换的话欢迎喔> <) 不过後来换到一个不错的系统，目前是可以抽得不错 所以样本很重要 当然板大们说的，用途也是考虑重点 我自己的实验有用过两种不同的DNase 一是Ambion TURBO ←印象中是大写？ 呃，印象中这个方法还是需要37度吧..因为那是DNase的最适反应温度 之後是用resin去做binding把酵素吃下来 通常会接酒精沉淀，可以达到很好的quality 目前听别人的经验谈，回收率约在80%左右 但还是要看样本特性 如果实验上不需要small RNA 我们的另一个方式是用Fermentas的酵素搭配一种比较没那麽贵的column 会比过CI回收率要好一些 操作上反应的时间是室温15分钟 (再加上过column的时间) 效果不错，可是small RNA无法保留 以我们实验室精打细算省钱到不行..我想这应该是目前属一属二省的方法 另一位板大说的跨intron这个有在报告上看到过 但为了配合primer的性质和位置 不一定刚好会有办法跨 当然如果可以那真的一劳永逸 只是啊 像我的样本DNA残留严重会影响RNA的定量 (真的有够难搞的啦 xD 所以真的是不处理不行了... cDNA是可以做成双股的 有听说过做双股跑胶会smear一整片 可以用smear的范围判断你可以作为template的大小 希望对你有帮助 > < ※ 引述《Rarelay ()》之铭言： : ※ 引述《chiehdis (chiehhime)》之铭言： : : 或许你可以搜寻我ID(小写a + chiehdis) 看一下是不是类似的问题 : : 如果是的话 相关回文可以看一下 那篇作者很厉害 帮助我很多~~ : : 另外 基於如何去除gDNA又保持RNA不被降解~提供给你一些我查到的方法： : : <<DNase>> : : 我们家本来用Ambion Turbo ~ : : 方法是加入 enzyme 和 buffer 後 65度 incubate 30分钟 : : 再加入inactivation reagent 4度五分钟後离心取上清液 : : 但RNA浓度和品质受到不小影响~(我想可能是高温的关系) : : (但也很可能是我自己操作的失误 : : 因为有强者同方法依旧得到超好看的电泳和数据~) : : 改良方法 : : 1.Fermentase 37度 (较低温) 10分钟(缩短时间) : : 2.Roche 室温(较低温) 20分钟(缩短时间) : : 缺点：但是以上两者皆要过CI 步骤增加 回收量就会少~!! : : 3.Ambion 以resin当成inactivation reagent (避免化学或热伤害RNA) : : http://www.ambion.com/techlib/tn/114/10.html 有原理和比较详细的说明~ : : 缺点：听说奇贵无比!!!! : 其实也没有很贵XD : （我们是减量到一组可以用 120 rx'n，这样一个反应在 30 元左右） : （这个版应该可以大约的说一下价钱吧？！） : 他的 DNA 活性很好，而且 inactivation reagent 中加有防止 RNA 降解的物质， : 所以效果就更好了。 : : <<Kit>> : : 1.Qiagen 的 column : : 缺点： 较贵 且无法操作很大量~~(对我来说~因为我要的量很多!!!) : : <<直接在抽取过程中去除DNA>> : : 1.TRIzol v.s RNAzol : : 这是我打去询问一个RNA乾燥产品时 sales提供我的~ (可以跟她拿个3ml的sample试用~) : : 和粉红色的TRIzol不同 RNAzol是清澈的蓝色液体 : : 号称是TRIzol系列第四代~~ 不用加CI 抽完RNA也不用去DNA : : 价钱是TRIzol的两倍 : : 但是依我用来抽取真菌的RNA看来 是没有DNA污染 但Nanodrop的值很差~ : : 浓度 纯度 260/230(我用来看多醣污染) 都比TRIzol低 : 这玩意儿真的不大好用。 : : 所以就被我丢到一边了....... : : (听说抽取另一种真菌和植物的quality也都不好...) : : 缺点：贵 效果又不佳 : : 最後结果 : 不管是哪种抽取的方式，肯定会有 DNA contamination。 : 毕竟 RNA 跟 DNA 长得太像了，是绝对不可能完全分开的... : Qiagen 的 kit 有两种， : 一种是加 DNase 在 matrix 上处理（当然也可以 elute 後处理） : 另一种是配有 gDNA elimination column。 : 听说这玩意儿的效果相当好。 : 你也可以跟 Qiagen 买配合 TRIzol 使用的 kit， : 也可以选购 gDNA elimination column。 : 这样你就经过两个步骤去除 DNA contamination (TRIzol phase separation/column) : 但这玩意儿真的是贵到...= =" : : 後来去找了TRIzol的protocol来看 发现其实它本来就可以去除DNA了!!! : : 我有跑过非变性电泳~(抱歉手边没图 有空之後补!!) : : 大於1kb的地方都很乾净~~ : : 其实TRIzol可以用来抽DNA DNA在分层的地方应该会被分到有机层 : : 所以在分层提取的时候 如同之前文章版友的建议 : : 尽量不要吸取到蛋白层的部分 牺牲多一点!!!!! : : 就可以避免掉DNA的污染了!!! : 其实用 TRIzol 污染超严重的。 : 如果你有处理过原核样品，真的是相当恐怖... : 我自己的经验是，就算 chloroform 加下去只取 300， : 不转 cDNA 直接拿 RNA sample PCR (negative control) : 大概 35 cycles PCR 产物就饱和了... : (25 就看的到了) : 所以我们是有处理 Turbo DNA-free : 而且原核样品还加长时间处理到 1 小时。 : : 以上是我的经验 如有错误 请多指教及海涵~ : : 也期望其他版友能提供建议!! : : 希望有帮助到你 一起加油吧:) : 做 real-time PCR 用跨 intron 的 primer set， : gDNA 还是会被放大， : 只是不容易变成倍增状况而已。 : 但是这基本上是没有人可以给你任何的保证。 : 尤其是你用 sybr green 或其他 DNA binding dye (EvaGreen, LC green... etc) : 如果你把 primer 跨 intron，也就是你的 primer 是由两段 exon 组成头尾的， : 这样状况会稍微好点。 : 但是还是没办法保证绝对不会放大出不该放大的片段。 : 所以我觉得 sample preparation 要尽力到把样品处理到只剩下 RNA。 : 让你的样本越乾净越简单就越好。 : 接着，如果是持续侦测的基因， : 会建议你设计跨 intron 的 TagMan probe or pNA probe， : 避免使用 DNA binding dye。 : 如果不是持续侦测的基因（如初筛） : 则建议你除了把 primer 设计跨 intron 外， : 在跑完 qPCR 後用电泳胶片确认。 --

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