作者ab15920 (瘾)
看板Biotech
标题[求救] Immunofluorescence
时间Wed Sep 7 23:40:00 2011
各位朋友～
最近在做Immunofluorescence 一直出现有nonspecific....
不知道如何解决他＠＠ 困扰我好几个月
我要染的protein（一种cytokines）会在细胞质出现
我有作一组negative control 一直在核中出现nonspecific
不知道要怎麽解决
以下是我的实验步骤：
1. Add 3% paraformaldehyde at RT for 15 min
2. Wash 2 times with PBS, 10 min each
3. Add 0. 1% Triton X-100 (diluted with PBS) at RT for 10 min
4. Rinse 3 times with PBS, 5 min each
5. Add blocking buffer (0.5% BSA or Normal Rabbit Serum in PBS) 30 min, 37℃
6. Add 1st Ab (Rabbit anti-CCL28) at O/N, 4℃
7. Wash 2 times with PBS, 10 min each
8. Add 2nd Ab (Goat Anti-Rabbit) for 1 hr, RT
9. Wash 2 times with PBS, 10 min each
10. Counterstain: DAPI (0.1 ug/ml in PBS) 30 sec, RT
11. Wash 2 times with PBS, 10 min each
请问一下我的步骤有哪边是错误的或需要修改的
ps.我也有试过IHC，一样也是核会有nonspecific....
谢谢大家指教了
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宁愿辛苦一阵子，也不要辛苦一辈子。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.226.185
1F：推 smallwang30:步骤看起来很OK，硬要说的话BLOCKING浓度有点低 09/08 10:34
2F：→ smallwang30:你的NC是指没有加一抗吗？IHC的NC有相同情形吗? 09/08 10:36
3F：→ smallwang30:如果只有IF的NC有可能是你的片子有自体萤光换个二抗波 09/08 10:37
4F：→ smallwang30:如果连IHC的NC都有(你有加H2O2吧)那可能就难解了!! 09/08 10:39
5F：推 uouim:blocking用的normal serum,我会选跟二抗来源同物种的 09/08 16:18
6F：→ ab15920:我的NC在IHC或IF是没加一抗的，一样都会有nonspecific 09/08 17:01
7F：→ ab15920:我也有用过normal serum for 二抗的，还是会有nonspecific 09/08 20:55
8F：推 davideason:只能说这就是人篸~换抗体试试吧 09/08 22:48