我使用的column是Sartobind IDA 75 欲纯化的protein为His-tagged EGFP protein，6xhis-tag接在EGFP的C-ter. 用2xLB medium养菌并且induce後抽取cell lysates的上清液，上清液呈现明显的绿色 用蓝光激发後可观察到明显的绿色萤光 因此我想纯化出存在上清液中的EGFP protein Sartobind IDA的原理是利用iminodiacetic acid来chelate二价离子再利用二价离子去抓 histidine 我使用的buffer分别如下： Equilibration buffer (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH4.5) Charging buffer (0.5 M NiSO4 in ddH2O) Washing buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH8) Elution buffer 1 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH8) Elution buffer 2 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH8) 以上buffer均先过0.22 um filter Loading的顺序如下： 10 mL ddH2O -> 10 mL Equilibration buffer -> 10 mL Charging buffer -> 10 mL Equilibration buffer -> 10 mL ddH2O -> 10 mL Washing buffer -> 5 mL sample -> 10 mL Washing buffer(每 1 mL 收一个fraction) -> 5 mL Elution buffer 1 -> 5 mL Elution buffer 2 (每 1 mL 收一个fraction) 结果如下： Sample flow-through 的滤液呈现明显绿色，蓝光激发後有明显的绿色萤光 Washing fraction #1-#3 用Nanodrop spectrophotometer测A280有吸收值 蓝光激发後有绿色萤光，其余则在A280的吸收值很低且无绿色萤光 Elution fraction A280的吸收值全部很低并且全无绿色萤光 请教一下各位大大 这样的方法哪里有瑕疵吗 基本上完全是依照user manual的protocol 可是从结果看来，EGFP protein应该是完全没有被Ni2+抓住 虽然尚未做Western blot来确认 但从A280的值看来Elute出来的fraction几乎是没有protein的存在 麻烦各位了 --

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