作者alicialai (Fairy Monster)
看板Biotech
标题[求救] 蛋白质定量
时间Wed Jul 20 23:11:56 2011
大家好, 有一些蛋白质定量为跑western的问题想请教大家的意见,
主要是要看细菌感染细胞株(RAW)之後细胞内特定蛋白的表现量,
对未感染的细胞是用RIPA buffer再用BCA assay定量,
程序就很一般般的处理方式加入RIPA, ice, 离心後取supernatant定量,
但对感染的细胞而言我就碰到了些问题,
因为此菌为PC2-PC3 level, 会经由呼吸道传染并为潜在性生化武器,
只要是有活菌都必须得在hood中操作, 除非经过高温杀死所有的活菌, 然後问题来了,
RIPA打破细胞膜, 但菌还是活着, 我总不能把整台ELISA reader搬进hood吧,
有试过直接用sample buffer, 然後直接在hood中高温加热,
但此法造成我的loading control不是说非常的even,
想问说, sample buffer还可以测BCA assay吗?
所以想请问大家是否有好的提议, 只要高温加热後就可以将细胞移出hood,
目前有想到几个方案, 但不知道行得通否,
1. RIPA作用刮下细胞, 高温, (移出hood), 冰上15min, 离心, 定量
(此法tricky点在於我不太确定RIPA buffer是否可以加热)
2. 用water作用将细胞刮下, 高温, (移出hood), 加入等量2X RIPA buffer,
冰上15min, 离心, 定量
3. sample buffer作用刮下细胞, 高温, (移出hood), SDS-PAGE
(这是最快速也简单的方式, 但这样我就无法定量了, 对吗?)
这三种方法是我目前想到的, 不知道大家是否有其他的建议呢?
很感谢大家拨空看我落落长的文章..
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
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◆ From: 116.240.163.37
1F：推 captdavince:刮下. supernatant 过filter?但是要考虑到膜的binding 07/21 02:25
2F：推 captdavince:要不然你可以考虑买台Qubit..小台到不行.. 07/21 02:30
3F：→ alicialai:可是我要看的是细胞内的蛋白, supernatant没有@@ 07/21 07:12
4F：推 captdavince:lyse掉.整个lysate过filter能把你的病原菌乾净的拿掉? 07/21 12:26
5F：推 wdman:取一小部分用方法一定量，知道浓度後，再取所需量加sample 07/22 00:33
6F：→ wdman:buffer 去煮，再run gel 07/22 00:33
7F：→ alicialai:所以RIPA buffer是可以加热的吗???? 07/22 06:38