※ 引述《alicialai (Fairy Monster)》之铭言： : ※ 引述《wenwentien (期待雨後的彩虹)》之铭言： : : 大家好,目前在进行ligation碰到了问题, : : 请大家帮帮忙 : : 我目前要接的insert约1.6k,而vector是8.4k左右 : : insert是先用PCR放大(在primer各加BamHl以及Xhol的切位), 接TA clone, : : TA clone sequence结果正确, insert与多加的限制?切位也都有, : : 之後将insert与vector加入BamH1与Xhol切, 37度, 2.5~3小时~ : : 跑胶结果大小都正确~ : : 经过gel elute之後insert浓度约94ng/micro liter : : 而vector浓度约18ng/micro liter : : V:I condition= 1:5, 因此ligation体积是V:I=1 microliter:5 microliter, : : total volume是10 microliter, ligation buffer是10X的, : Hi, 这边就有问题了喔~~ : 所谓vector:insert = 1:5, 指的是molar ratio=1:5, : 不是volume=1:5, 依照您的做法算出来的molar ratio已经高达1:262, : 而且通常vector的浓度至少必须要50ng(100ng would even better), : 18ng有一点太低了, 就算是high copy number + commercial ligation, : 要挑到positive construct应该蛮难的吧~ 不好意思啊,我这边没交代清楚, 我ligation时, vector是94ng(94ng*1 microliter), insert是90ng(18ng*5miccroliter).所以对应的体积是V:I=1:5, 又由於我vector长度是insert的5倍,所以molar ratio与体积比相同 : : Ligation用两种方式进行: : : 在16度里overnight(a)与4度overnight(b) : : transform也用两种方式: : : 放冰上15min直接涂盘(c) : : 涂盘之前加入SOC medium, 37度, 1hr後涂盘(d) : : 因此有a-c,a-d,b-c, b-d四个plate, 但今天结果是一个colony都没长~ : : 想请教各专家, 我会是在哪个步骤出问题呢? : : 谢谢各位专家~ : 关於transform, 请问... 您有做heat shock吗?? : 不好意思, 因为您说冰上15min直接涂盘, : 我会直接联想到where is the heat step?? : 在此假设您有做heat shock, : 在请问您为何要用SOC medium啊??? : 您transform的是不是比较特殊的E. coli strain呢? 我的两种competent cell都是 DH5-alpha, 很常见的E.coli (c)的直接涂盘是真的没有heat shock (按照protocol的步骤,就只放在冰上,虽然我一开始也很怀疑,但还是决定先follow), 所以alicialai专家认为仍须heat shock比较适合? (d)的transformation就有heat shock,会用SOC medium是厂商附的,由於之前TA clone 是用这款competent cell,有成功,因此就不疑有他, 所以SOC medium是for特殊的菌种吗?我改成LB会比较好? 谢谢alicialai专家的指导~ 我的做法是transform後加LB进37度shake 1hr再涂盘~ : 目前为止只要不是太龟毛的strain and plasmid, : (是的敝人目前也正shffer在龟毛的S17 and pDM4.. Orz) : ligation and transformation没出过甚麽大问题说~ : 希望有帮助到您喔^________________^ : 有问题在互相讨论~ --

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