※ 引述《wenwentien (期待雨後的彩虹)》之铭言： : 大家好,目前在进行ligation碰到了问题, : 请大家帮帮忙 : 我目前要接的insert约1.6k,而vector是8.4k左右 : insert是先用PCR放大(在primer各加BamHl以及Xhol的切位), 接TA clone, : TA clone sequence结果正确, insert与多加的限制?切位也都有, : 之後将insert与vector加入BamH1与Xhol切, 37度, 2.5~3小时~ : 跑胶结果大小都正确~ : 经过gel elute之後insert浓度约94ng/micro liter : 而vector浓度约18ng/micro liter : V:I condition= 1:5, 因此ligation体积是V:I=1 microliter:5 microliter, : total volume是10 microliter, ligation buffer是10X的, Hi, 这边就有问题了喔~~ 所谓vector:insert = 1:5, 指的是molar ratio=1:5, 不是volume=1:5, 依照您的做法算出来的molar ratio已经高达1:262, 而且通常vector的浓度至少必须要50ng(100ng would even better), 18ng有一点太低了, 就算是high copy number + commercial ligation, 要挑到positive construct应该蛮难的吧~ : Ligation用两种方式进行: : 在16度里overnight(a)与4度overnight(b) : transform也用两种方式: : 放冰上15min直接涂盘(c) : 涂盘之前加入SOC medium, 37度, 1hr後涂盘(d) : 因此有a-c,a-d,b-c, b-d四个plate, 但今天结果是一个colony都没长~ : 想请教各专家, 我会是在哪个步骤出问题呢? : 谢谢各位专家~ 关於transform, 请问... 您有做heat shock吗?? 不好意思, 因为您说冰上15min直接涂盘, 我会直接联想到where is the heat step?? 在此假设您有做heat shock, 在请问您为何要用SOC medium啊??? 您transform的是不是比较特殊的E. coli strain呢? 我的做法是transform後加LB进37度shake 1hr再涂盘~ 目前为止只要不是太龟毛的strain and plasmid, (是的敝人目前也正shffer在龟毛的S17 and pDM4.. Orz) ligation and transformation没出过甚麽大问题说~ 希望有帮助到您喔^________________^ 有问题在互相讨论~ --

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