作者golden3p (两光帮帮主)
看板Biotech
标题[求救] 想请教有做过EMSA的前辈
时间Wed Mar 30 22:47:51 2011
各位前辈：
我们买了一组EMSA的kit(pierce的)来做RAW 264.7 细胞的NFkB
可是很奇怪的是 我们用LPS刺激细胞後
在WB中可以看的到磷酸化的P65的确有因为LPS的刺激而上升
(且negative control没有band)
但是做EMSA的时候 相同剂量的LPS刺激相同的时间却没有比negative control高很多
(事实上我设想说negative control的位置应该要跟WB的结果一样 没有band)
我们有用没标记biotin的相同序列去做竞争 也的确有被竞争掉(band 消失了)
再更严谨一点的用P65跟P50的抗体去做supershift 想证明的确是那条band
不过却失败了 加了抗体跟没加抗体的相比之下没有差异 位置没比较高 量也没少
我已经有写信问美国pierce公司技术部门
他们给我的回应是 竞争有做 且作的漂亮 应该就是了
只是为何LPS刺激後没有比control高很多 他们也很困惑
不晓得有做过这个实验的前辈们能否给我一些意见?
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