作者kenshinsandy (开心听金属˙ε˙)
看板Biotech
标题[求救] cytosol及membrane protein extration
时间Sun Feb 27 03:18:19 2011
最近需要将细胞cytosol及membrane bound的protein分离
但是membrane的一直抽不出来 或是抽的量都很低 无法做western.
请各位大大们帮我看看是哪里需要改进><"万分感激!
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Protocol:
1. 收细胞 (10cm dish满盘收成一管)
2. 加sonication buffer A 洗一次，离心16,000g x 2min
2. 加sonication buffer B (100ul/管)，进行sonication把细胞震破
(震30秒停30秒，共10分钟)
3. 超高速离心100,000g x 40min，收上清 →(为cytosol soluble protein)
4. 加sonication buffer C (50ul/管)，suspension pellet，插冰20min
离心16,000g x 20min，收上清 →(为membrane protein)
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过程中有几个小问题请教一下：
(1) 超高速离心後的pellet根本无法用50ul就suspension起来，我都用tip把pellet刮出来...
(只用50ul是怕加太多最後抽出的蛋白太稀...)
但是我看网路上trubleshooting有人说加太少可能会不足以溶出蛋白
(我配的buffer C有Triton X-100)
→所以到底要用多少体积才够溶呢~"~???
(2) 超高速离心完的pellet虽然刮出来了，但是就算vortex也无法完全打散该怎麽办呢?
(Vortex 10秒，插冰10秒，持续8min/管，虽然有打散一些变浊，但仍有小团块)
→目前自己觉得最可疑的应该是这边抽不好~"~a
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跪求高手帮我解惑 <(_ _")>
小妹感激不尽ㄒ_ㄒ
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