作者boblu (六百)
看板Biotech
标题Re: [求救] 一些关於blocking的问题
时间Sun Feb 20 12:31:46 2011
※ 引述《owl628 (owl628)》之铭言：
: 因为最近开始接触western跟ICC
: 大部份都是到处问人以及上网找资料做的
: 因此有些关於blocking的部分有点疑问
: blocking中使用的脱脂牛奶里面的蛋白质会均匀的附着在你的membrane上
: 藉此避免後续的抗体反应造成一些非专一性的结合
: 想请问这里所说的後续抗体,是指一抗或二抗,或是都是
都是 但主要是一抗
: 此外有看到说假如进行有关磷酸化蛋白的WB
: 就只能用BSA进行blocking,是因为牛奶中含有磷酸化的蛋白质吗???
不熟。略。不过我听过类似的说法
: 最後就是进行ICC时他的blocking buffer要针对二抗来选择
: 假如二抗是goat anti-mouse,就要用normal goat serum,有点不懂原理为何???
二抗里面可能有一些非专一的抗体，
且这些非专一的抗体也已经被 tag 上酵素或其他的东西
所以当他们黏到你的样本上以後 就会被侦测到
加入跟二抗同样来源的 normal serum
几乎可以这里面说一定（<--收物学上说这两个字很危险，不过你知道我的意思...）
也有跟你的二抗一样的非专一抗体
但是 normal serum 里面的当然没有 tag
因此就会跟二抗中的非专一性抗体竞争，产生占着茅坑不拉屎的效果
: 不能用牛奶,BSA之类的吗???
可以 跟二抗同源的血清是最安全的选择但也是最贵的
其他 blocking agent 可不可以只有试了才知道
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 97.92.0.42
1F：→ saviora:牛奶里面会有磷酸化的casein 02/20 12:50
2F：→ blence:其实我染过sigma的BSA也有phosphorylation,另外目前针对磷 02/20 23:40
3F：→ blence:酸化蛋白的抗体也用milk也做的好好的 02/20 23:41
4F：→ zeratul1396:我家的BSA也有 现在很困扰 老是脏脏的 02/21 10:06
5F：→ zeratul1396:有大大有推荐的BSA厂牌吗?? 02/21 10:06
6F：推 chrissim:我做磷酸化用牛奶也好好的..BSA厂牌应该很多人用SIGMA吧 02/21 14:38
7F：推 leoblack:BSA做起来通常会比milk脏没错,毕竟milk中蛋白质比较多元 02/21 15:05
8F：→ leoblack:blocking效果会比BSA好,但磷酸化实验,用milk做得出来,那 02/21 15:07
9F：→ leoblack:是你运气好,买到不错的抗体,但请不要当成常态来看待 02/21 15:08