作者xareelee (XareeLee)
看板Biotech
标题[求救] Transfer 200 kDa的protein 效果很差
时间Mon Feb 7 21:06:38 2011
我们实验室之前都是用semi-dry的方式 但是200 kDa常常transfer效率不好
semi-dry的条件:
gel: 7.5% acrylamide gel (thickness: 1 mm)
buffer: 20% methondal, 192 mM Glycine, 25 mM Tris (没调整pH,但应在8附近)
current: 280 mA
duration: 30 min
membrane: NC membrane (pore size: 0.45 micron)
试过把methanol降为10% 结果也是一样！
我们是用Cell Signaling Technology (CST)的biotinylated marker (#7727)做测试
http://www.cellsignal.com/products/7727.html
140 kDa的marker勉强压得出来 但是200 kD就几乎看不到
就算压到30分钟也是几乎没有
後来改用wet transfer (GenePure system)
gel、membrane和buffer的条件一样
但是current改用300/350/400 mA且duration测试1/2/3 hr的交叉测试
都完全没有办法压出明显的200 kDa
10% methonal也测过了
也试过增加0.05% SDS到trnafer buffer内
效果都不佳
现在要压western看 200 kDa的target完全不敢做
因为连marker都压不出来
做下去只是浪费时间和抗体....
想问一下有没有人做过>200 kDa的western blot
能够提供您的tranfer条件
谢谢！
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 111.82.62.18
顺便问一下大家的gel和NC membrane会泡在transfer buffer内多久呢？
※ 编辑: xareelee 来自: 111.82.62.18 (02/07 21:14)
1F：→ aborwang:时间拉久一点，先试1.5倍时间看看，protein在膜上其实很 02/08 01:22
2F：→ aborwang:难被transfer过头。另外，泡在buffer内5~30分钟 02/08 01:24
3F：→ aborwang:NC membrane和PVDF适合的protein也不一样，构造原理不同 02/08 01:38
4F：→ chvkimo:我是有试过湿式 transfer over-night, 30V 4度C 02/08 06:00
5F：→ chvkimo:fermentas 的marker 250kD 可以, 不过我的target还是测 02/08 06:01
6F：→ chvkimo:不到 , 所以只能给你参考看看罗 02/08 06:01
7F：推 icome:用湿式 加0.1% SDS 02/08 08:24
8F：推 leoblack:200 kD的protein最好用wet transfer 02/08 10:49
9F：推 FENOR:我transfer过400kD的，当时是直接卯起来transfer四小时 02/08 11:18
10F：→ FENOR:不过我的membrane是PVDF的 02/08 11:19
11F：→ FENOR:而且电流我也只用了80mA 02/08 11:19
12F：推 henrywang:我的protein 450 kD, wet transfer with 0.2% SDS 02/08 16:03
13F：→ henrywang:50 V(定电压) 999 min 冷房操作 02/08 16:05
14F：→ rimeni:200kD: Towbin buffer, 0 or 10% MeOH, no SDS, 30V 16hr 02/09 12:32
15F：→ rimeni:OR 100V 120min OR 40V 750min; 请参考 02/09 12:34
17F：→ Danielle:改湿式的 很有帮助 02/09 13:20
18F：→ keeny:请用supersignal Femto ECL reagents 保证一定做出来 03/07 01:47