我最近也在收membrane protein 检体是rat spinal cord 是买Pierce 的mem-per reagent 那组kit 做到最後一个步骤,离心完, 也是分三层, 上层是hydrophilic phase中间是一个很不明显的interphase 下层是hydrophobic phase (应该跟原po是一样的分层?) 我要的是最下层的部份 它看起来一副就是充满detergent的样子 specilaist是跟我说她其他的user收完後直接拿来做western blot 但我照做了,最後看起来也是跟原po的RhoA一样 看说明书上是可以用pierce的某kit透析掉detergent 可是这样又要买东西了 ^^|| 除了想问跟原po一样的问题(去除detergent) 还想问问有哪位也用过这组收膜蛋白的kit,之後做western的?? 做出来也会这样吗? 要如何解决这样的问题?? 或是在配running用的检体时,用PBS或TBS去调整浓度,让detergent稍微稀释掉一些?? 谢谢大家~ ※ 引述《waitingu (Phil-Ku)》之铭言： : 最近的实验必须要看 : non-receptor tyrosine kinase在不同条件下被recruit到membrane的情形 : 阅读了一些期刊後发现，普遍的做法是用Triton X-100 + sucrose gradient分层 : 此作法通常需要超高速离心 : 但好像也有一种做法是用Triton X-114去做分层，但不需要超高速离心 : (由於老师一直恐吓说如果超高速离心没处理好，会提早毕业但没证书，因此能尽量不用 : 就不用那台老机器)，因此... : 1. 想请问一下，这两种做法的差异性在哪？ : 2. 如果是Triton X-114这种做法，所看到的分层现象，应该是 : (上层) 水层 (中间)Sucrose cashion (下层)detergent phase : 还是顺序有所差别呢？ : 3. 我试了几次 Triton X-114作法 : 发现可以抽出membrane-associated protein (例如Rho) : 但SDS-PAGE跑出来的band却会smear(如图 : http://img545.imageshack.us/f/25531824.jpg/右边那条) : 推测可能是detergent含量太多，但如果用Acetone沉淀後，蛋白会无法回溶 : 请问版友们对去除detergent步骤是否有好的建议？ --

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