作者monicatsen (monicatsen)
看板Biotech
标题[求救] ligation+primer desing
时间Thu Dec 9 23:45:54 2010
最近在做长片段的ligation
insert片段为2.3k
vector 6.4k
但一直接不起来 涂盘都没长clone
insert及vector酵素切overnight
接着做纯化
ligation 现在用的条件是照ligase的protocol
I:V=3:1
22度 overnight
胜任细胞也是用买的(其他人用ok)
基本上我所有使用的酵素、buffer其他人都有用
所以不觉得药品的问题
目前的策略是
先将PCR product送定序确认是否为目标基因
及再重新抽新的vector再重新切过
想问一下大家有没有其他的建议
另外想请教大家:
我爬了前面的文章 有提到关於RE site
我在primer设计的时候
没有在酵素切位前多留nt
------XXXXX
(-是酵素辨认的序列，X是我的目标基因，-前面我没多留nt)
这对接长片段insert会有影响吗?(怕RE没办法认?)
又如果我要重设primer应该要补多少个nt
而这些nt是不是有建议要ATCG哪一个比较好?
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◆ From: 122.116.97.104
※ 编辑: monicatsen 来自: 122.116.97.104 (12/09 23:49)
1F：推 williamyang:要不要先做TA cloning把PCR产物接进去再往下做做看 12/10 00:11
2F：推 hangzer:你如果是用NEB的限制酶 可以去查一下 我记得都要多留几个 12/10 00:41
3F：→ hangzer:base限制酶才能有效的作用 还有我也赞同楼上提的 先做TA 12/10 00:41
4F：→ hangzer:再去接会比较方便 12/10 00:42
6F：→ hangzer:酶的效率 有些需要多留base 才有办法切的动 12/10 01:03
7F：→ blence:不是看oligonucleotides,要看linearized vector的表才是 12/10 01:32
8F：→ fcku413:推H大的那个 当初PCR也是根据那个 要注意切的时间 12/10 02:05
9F：推 yaliu:不留mer是切不起来的~若真不想留mer，只能作TA cloning了 12/10 08
:28
※ 编辑: monicatsen 来自: 120.126.52.76 (12/10 18:00)
※ 编辑: monicatsen 来自: 122.116.97.104 (12/10 22:28)