作者FDynasty (a chain of stories )
看板Biotech
标题[求救] PCR结果从正常变成杂band四起
时间Sat Dec 4 23:18:58 2010
这几个月来快被PCR搞疯了...
7月时订了两组primer，在质体pBR322上PCR
做gradient後找到了最佳温度，也成功地做出预期中的single band产物(各为600bp和680bp)
於是开心过暑假，等下学年开学正式开工
到了9月，我把存在-20度冰箱的诸位stocks们重新取出分装，用同样条件来PCR时，
却发现出现好几条杂bands(都是偏高,大约800,1500附近，强度约是主要产物的1/3)
两组primer的rxn都是
这让我不禁怀疑是不是药品有问题? 於是不停的试，
最後除了primers、template没买新的(primer一条一万多，买不下手)，
其他都换新的了
还是一样。
想请问大家，明明条件完全一样，隔几个月就从单一产物变成杂band四起，
通常是什麽原因呢?
药品坏了?
共用仪器污染?
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期间唯一一个成功的改良尝试是在PCR rxn中加入final conc.为50 mM的LiCl,
它让我产率下降，但是成功消除了杂bands
(注: 之所以用LiCl是因为别的考量，一言难尽，和那个$10000的潜在二级结构有关)
所以近期有想尝试微调反应条件了....
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补充自己的实验内容概要
这一部份实验是纯粹DNA操弄，
用两组primer各批出600bp,680bp的产物，
再将600bp的一边尾巴用限制脢(Fok1, NEB)切一刀(切下20bp)，和680bp ligate在一起。
(之所以680bp能够直接拿来ligate是因为它的5端带有约30bp的extension,是sticky end)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 122.126.48.168
※ 编辑: FDynasty 来自: 122.126.48.168 (12/04 23:19)
1F：推 Rarelay:为什麽你的primer这麽贵？ 12/05 21:35
2F：推 bluecsky:看长度跟纯化方式 应该是PAGE纯化吧 12/06 08:50
那条其实是正常20个mer的primer後方额外接上30mer,
贵是贵在其中两个位置是abasic site(去掉硷基),以进行autostick PCR
※ 编辑: FDynasty 来自: 140.112.52.126 (12/06 14:21)