我目前进行的是cell cDNA 的PCR 有两个目标基因,741bp和608bp 分别由NCBI上两者的mRNA sequence进行primer的设计 PCR的酵素为advantage PCR 条件如下: 10X buffer 2.5 ul 10uM primer 1 1ul 10uM primer 2 1ul 2.5mM dNTP 2ul cDNA 0.5ul enzyme 0.5ul ddH2O 17.5ul 95C 1mins 95C 30sec 68C 3mins 35cycle 68C 3mins 4C --- 或是 95C 1mins 95C 30sec 54C 30sec 68C 2mins30sec 35 cycle 4C --- 主要的问题是我都有P到东西,但是切下後做gel clear ,TA clonig 并以T7 sp6 primer做PCR check都是对的size 但是sequence之後结果都不是我要的基因 利用Blast确认过我的primer都可以辨识到我的目标基因 也重新设计过primer取不同区域做 目前在试pfu但是就得不到我要的片段大小 我的primer有两种设计一种是有cutting site的,长度25mer 另一种是没有cutting site的 长度约为20个mer 想请问我现在必须再重新设计primer会比较好? 还是PCR条件有什麽方法可以改进 因为一直有P到东西但是又都是错的,很耗时间 是否有办法再送sequence之前能确认? 有cutting site的PCR product我也试着切酵素了,有切出来对的大小,但sequence还是错 麻烦各位先进了 我也换过不同的cDNA了,结果还是差不多..... 另外也请有用过e-PCR的人教我怎麽用...看了半天玩不出来 -- . ′人生五十一睡梦 .＊ * ◢ ◢◣︿◢◣ . ＊* 一期荣华一杯酒 *′. ◤◣ ◤︺◥ ◢ ▁▁ ◤◣μ◢◥ - 上杉谦信(1530~1578) - ※ ◣◢︸◣◢◤◣ --

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