作者evergreen215 (evergreen)
看板Biotech
标题Re: [求救] buffy coat的分离
时间Thu Oct 14 23:05:38 2010
※ 引述《Feting ( ><>J <>< し<><)》之铭言：
: 小弟是理工背景实验室的同学
: 最近需要使用白血球进行实验
: 加了heparin的血液，用3000rpm、4度c、离心15分钟(没有使用ficoll)
: 之後可以看出血液的分层
: 但是却不知道要如何将buffy coat从血液中抽出来
: 其实我也不是很确定我以为是buffy coat的东西到底是不是buffy coat
: 应该是离心後中间那层很薄的灰白色层吧?
: 想请问各位前辈有甚麽方法可以将buffy coat给分离出来
: 另外，buffy coat分离出来是甚麽样的状态?
: 是液体，还是一片胶状的东西?
: 因为看到某处的操作说明说buffy coat如果够坚固的话，可以将整片buffy coat挑起
: 由於实验室的学长姐也没使用过白血球做实验，对这些实在不清楚
: 希望各位前辈可以给予指教
: 谢谢
你需要白血球做什麽实验?进一步来说不同实验需求有不同的做法
(以人血为例)
要抽gDNA:
heparinized blood > 2,500xg for 10min at 4℃ > 抽掉plasma >
抽buffy coat
(需要技巧,简单说就是用开口较大的tip慢慢沿边缘吸起,很难避免吸到RBC;
可进一步加入RBC lysis buffer去除RBC) or
将下层含RBC与buffy coat全部以3倍以上体积的RBC lysis buffer处理
lyse完RBC後500xg for 2min > pellet(WBC)抽gDNA
取PBMC要culture:
已移除plasma的blood+等倍体积的BSS,mix well > 叠在Ficoll-Paque Plus上 >
400xg for 30-40min at 18-20℃ > 取PBMC层(比buffy coat好取很多) >
BSS or PBS wash to remove Ficoll (60-100xg for 10min at 18-20℃)
分层完的RBC上头会有一层灰白色的颗粒球,也可再利用RBC lysis buffer分离出来
Buffy Coat是很杂乱的一大群细胞,
有时候人体处於某些症状时该层会非常大,也会比较好取
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