※ 引述《honeytea96 ()》之铭言： : 小妹我目前在做关於cloning及biosensor相关的实验 : 一开始做PCR 用proof reading Taq做了好几次都鬼打墙 量非常少 : 後来老师可以用普通的Taq做 目前做出最好的情形大概是以下的照片 : http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4868394307/in/photostream/ 建议用2% gel跑，至少你的gene可以跟primer分开一点 : 三个sample都是P recA 基因 : 後来纯化将三管混合作 PCR product的purification 图大概是这样(从右边数来第二个) : (PCR纯化我是用kit作 最後Elution solution的量是加12ul) ^^^^^^^^^ 你指的是clean up吗？ 这个步骤我建议你elution体积可以多一点 诚如版友所说的30-40ul，然後直接把它全部都拿去切 : http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4868396741/in/photostream/ : (不知道为什麽变比较淡~"~) : 後来继续作到BamHI和XbaI的double digest 以下是digest program : [insert] [vector] : volume(uL) : buffer3 3 3 : BSA 3 3 ^^^ 你有稀释？我通常就拿原液意思意思加1ul 感觉他的功用就是帮忙稳定enzyme之类的(?)，浓度不用很在意 : insert 8 5 : BamHI 0.3 0.3 : XbaI 0.3 0.3 : dH2O 15.4 18.4 你可以做50ul，insert DNA就拿刚刚clean up後的DNA全部都下 enzyme不用这麽省，各1ul（因为我要确保它真的切乾净，如果DNA量很多我还会再加） 其实这一步阿我会做到不补水，也就是说bf 5, BSA 1, enzyme各1, 所以clean up我会elute 45-50 ul....（elute完体积会少一点） 然後37度作用个4小时 vector的制备也是，你要确保它真的都能切得很乾净 当然每经过一步纯化，一定会lost掉很多DNA 所以一开始你就要有很多vector（反正就菌养多一点萃） insert是PCR来的，应该会有很多吧?? : 这是digest overnight 後的图(抱歉已经切过胶) : http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4869015092/in/photostream/ 我觉得你这样切有点危险耶，要不要跑2%，跑开一点 还有要记得限制酵素作用的那管全部都要下去gel extraction vector一样切胶纯化，当然啦不要浪费全都要拿去gel extraction vector部份用1% gel，一样要跑开一点 另外，还有一个观念要说 虽然gel上看不到，但不代表DNA不存在 如果确保每个步骤都没问题，虽然电泳看不见，也是可以做ligation的 最後再小提醒一下，PCR产物直接切，记得primer切位要留几个mer喔～～～ 以上，祝福你实验顺利！ : 中间第二到第四个由左至右算起分别是 : vector.insert.100bp marker. 1kb marker : 经过切胶之後 用kit作purification 结果照出来就完全没东西了Q_Q : http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4869017390/in/photostream/ : 已经经过了大概3次重复整个实验过程 : 都是到最後没办法作到ligation的部份 : 虽然我觉得是後来digestion之後量变少 : 但真的事要量够多到後来纯化过colum跑胶才看的到吗 : 希望各位大大能给一些意见喔 谢谢!!! --

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