大家好 最近在做 Western blot ，用 sonication 打破细胞时 常遇到 DNA 没有打碎完全的问题 在电泳时可以看到 sample dye 包着一坨东西"拖着"往下跑 二抗呈色以後也有发现 protein 比旁边少 我的实验简述如下 我是拿老鼠的脑组织（取特定脑区）以液态氮冻起来以後 加入 lysis buffer （配置比例如下） ======================================= RIPA 1000 ul Triton X-100 10 ul Protease (PMSF) 5 ul Protease inhibitor cocktail 5 ul ======================================= 一个 eppendorf 装的组织块重量平均约在 15 - 20 mg 左右 每管加入 50 ul 的 lysis buffer 之後以 sonicator （厂牌 Fisher Scientific, sonic dismembrator, model 100） 输出功率为 1 - 10 WATT (RMS) 进行细胞打破的动作（我使用的功率为 2.5 左右） 以 1 Hz 的频率，破十次，总共重复 5 次，也就是每管会打 50 次 可是这样子打下去 仍常会发现 sonication 不完全，Western blot 电泳会看到一坨东西 这样影响我之後的 protein expression 定量的程度还满大的 最怕的就是 variation 造成统计以後不显着 可是用动物脑组织最大的技术限制就是 每只动物只有一个脑，也就那麽点脑区可以用（用显微镜取出来不过一个米粒大小） sonication 打不好，如果是在关键区域的组织 那只就不能用了 因此想请问大家关於用 sonication 来准备动物组织 protein 进行 Western blot 是不是有甚麽建议或经验可以指教在下？ 个人怀疑是有时候因为在破碎组织块时 eppendorf 埋在冰下看不到 无法掌握 sonicator 的 probe 没有完全浸入 lysis buffer （有时候啦） 打出气泡，可能导致 DNA 因此未完全承受到破碎的力道？ -- 大学生：「你暑假有跟实验室吗？ ^^」 研究生：「你暑假有要出去玩吗？ orz」 大学生：「你周末有要出去玩吗？ ^^」 研究生：「你周末有去实验室吗？ orz」 = ψ goodfish700 φ = --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.121.239 ※ 编辑: goodfish700 来自: 140.112.121.239 (08/02 17:38)