作者mzac1b (Goodday)
看板Biotech
标题[求救] 请教关於制造病毒感染的问题
时间Wed Jun 9 12:52:39 2010
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
我在进行病毒制造与感染
用的是中研院RNAi core 的系统
http://rnai.genmed.sinica.edu.tw/Vector_Information_C6-6.asp
pMD.G
delta8.9
外加一个表现绿萤光的pGIPZ (lentiviral shRNAmir empty vector )
目前遇到的问题是感染率普通 (感染後三天流式细胞仪分析约 40%)
(有加polybrene, 加病毒液後有再离心1000g, 30mins)
但是萤光显微镜下可判读的萤光约只有10%
於是想提高感染率
我的老板提供的改良是:
1. 病毒液用2~3% FBS 之medium 去制造
避免病毒制造细胞活力太旺培养液太黄
影响titer
2. 病毒液感染後(加polybrene, 离心後)
由於病毒已经沾粘细胞
即可抛弃病毒液, 更换培养液 (一般protocol 似乎是泡在病毒液中一天)
然後我自己想的办法就是增加感染次数
目前预计每12hr 感染一次, 比较感染1, 3, 6 次的感染率及萤光强度
关於我老板说的改良方式
我没试过听起来毛毛的
想请问有经验的人
对於我目前进行的这三种促进方案有没建议意见
或是是否有其他有效的方案
感谢~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.14
1F：推 aceliang:病毒做出来有测titer嘛？ 06/09 14:16
2F：→ mzac1b:没有测 只有直接看萤光评估感染率 06/09 14:23
3F：推 aceliang:重复感染我试过效果不太好，试试看超高速离心嘛？ 06/09 14:24
4F：→ soom:重复感染，我试过4小时换一批病毒液，效果还不错 06/09 14:44
5F：推 williamyang:产病毒的293T也会影响titer,请问是用293FT吗？ 06/09 22:19
6F：推 icome:最有效的方法 浓缩 有贵桑桑的病毒浓缩试剂可买 06/10 06:41
7F：→ icome:或用sucrose cushion高速离心 有点麻烦就是了 06/10 06:42
8F：→ mzac1b:我是用293FT 因为怕麻烦 所以目前没打算作超高速浓缩 06/10 12:56
9F：推 icome:试试看细胞seeding的时候直接加病毒 隔天贴下去再换medium 06/10 18:09
10F：推 robertkoch:俺是用HEK293T产病毒 俺是用高M.O.I.解决感染效率 06/11 02:58
11F：→ robertkoch:大约会用到 M.O.I.=6 06/11 03:01
12F：→ robertkoch:大约就是2X10^5细胞对上RNAiCore方法的病毒液2ml 06/11 03:04
13F：→ robertkoch:6well的1100g0.5hr 96well的1100g2hr 06/11 03:06
14F：→ robertkoch:都只感染2hr~3hr就换新的media 06/11 03:07
15F：→ robertkoch:萤光隔天看会很弱 所以俺都是在收实验时也就是第三天 06/11 03:09
16F：→ robertkoch:才去拍萤光显微镜 大约可以观察到8成以上的感染率 06/11 03:11
17F：→ robertkoch:另外 目标细胞也会影响感染效率 06/11 03:12
18F：→ robertkoch:btw俺用的RNAi抑制该基因後会导致生长缓慢所以不太会长 06/11 03:18
19F：推 sweetE:是感染什麽细胞? 06/11 23:00
20F：→ mzac1b:大鼠脂肪干细胞 06/12 11:38
21F：→ chaunen:请问..超高速离心时, 没用sucrose垫在下面 会怎样吗? 06/15 22:58
22F：推 icome:部分病毒会破掉 会损失掉一些 06/16 06:14
23F：→ icome:脂肪干细胞的话可能本来就不容易感染 MOI要高一点 06/16 06:16