※ 引述《hellheavn (苍天落日)》之铭言： : 不知道版上的版友有没有人在专门摸FPLC : 或是有用过的 : 通常你们会遇到什麽样的问题 都如何解决咧 : 或着是清洗保养有什麽见解咧 : 想说来个推文或是讨论串交流一下 : 小弟不才 摸了一年还是一知半解的.... 分享一下使用经验~ 因为我老板曾跟我说：如果这台或这只column坏了的话 你明天也就不用出现了...(抖) 首先建议 使用比较高阶的仪器 能请专员示范教学一次是最好的 再不然至少要请使用过的在旁带领使用 因为使用不当 不只是仪器损坏 有可能会造成人身伤害 再来 预先作好防范比之後造成问题来的好 如果有问题 就通知原厂请专员来处理吧 注意事项要看你用什麽column 一只10万块的gel-filtration column的话 那就请小心谨慎并爱护的使用 如果是自己买resin来packing的小column 变慢、塞管或清洁还可以自己重packing就好 在使用时 不要爆管造成人身伤害就好= =a 我以gel-filtration column为例好了 一些要点需要注意的： 第一点、最重要的一点 "压力" FPLC是透过帮浦加压以推动溶液在管柱中流动 系统和column各有自己能承受的压力限度 (说明书有写) 所以使用时务必要注意压力值的大小 压力太小 溶液推不动 压力过高会造成系统受损或管柱爆管 而FPLC大多都使用玻璃管柱 所以可想而知 爆管的话...还蛮可怕的...(抖) 之前听专员说 有实验室爆过 "碰"的一声就粉碎了 还好那只column是有外套的(外面还有一层 可恒温的) 所以碎片没飞出来... 现在系统应该都有安全设定 请以压力限度最小的为设定值 以策安全 接下来其他点大多都由压力这点延伸出来的 第二点、流速 流速越快 压力也越大 除了爆管问题外 流速太快 长期会造成resin bed被压缩 影响分离效果 但流速太慢 实验也就跑越慢 老板催data压力也就越大... 所以自己平衡一下两者压力...|| 自己实验室应该都会有规定使用的流速 所以请照规定使用 而普遍(我所能看到的...)使用的流速大概在1ml/min左右或以下 第三、杂质 颗粒性杂质是不被允许的 包括药品不溶物、灰尘、毛屑等 造成塞管无法清除 而降低流速、分离效果 压力上升等 因此 所有要进FPLC的溶液 包括buffer和protein 一定要过0.22 um filter 除掉杂质 如果有杂质进入 自己packing的column还可以拆掉清理一下再重新packing 但如果是整只买来的...专员曾跟我说：我可以帮你重packing啦 但效果一定会变差... 因为原装column在packing时有压力设备 填装resin时可保持整只column密度均匀 但自己packing因重力关系 下层一定会比较密实 所以不均匀 效果会有很大的差别 送回原厂重packing？似乎没那个服务 不然就是要白花花的银子啦...@@a 第四、气泡 column原则上不可以有气泡在里面 气泡会使压力提高 以及影响column的均匀度 若长期气泡有存在 会使部份resin乾掉 就坏啦~ 所以进入FPLC的溶液要degas 免得在column中聚集出气泡 degas有不同方法 通说还有degas专用的仪器@@a 有人也用sonication的方法 而我是用抽气的 反正都要过滤了 所以就在抽气过滤後 让它多抽久一点就好 第五、蛋白质样品 打进column的样品越乾净 当然column也就不会有太多脏东西卡在上面 基本的离心、过滤是一定要做的 以gel filtration为例的话 最好把gel filtration当作second column 之前可用ion-exchange或affinity column做第一次纯化 分离大多细胞碎片、lipid、杂protein 再进一步纯化 可保持second column乾净 之後清洁也比较容易 还有一点 比较特殊 也比较容易被忽略 那就是蛋白质令人又爱又恨的特性 "沈淀" 特别是蛋白质有经过浓缩的 那请注意一下蛋白浓度跟buffer的成份 因为蛋白浓度太高会沈淀、buffer改变也可能使蛋白沈淀 如果跑FPLC用的buffer跟蛋白质所浓缩的buffer不同时 要稍微注意一下 是不是这样的转换会让蛋白质沈淀出来 免得样品一打进FPLC 全部沈淀卡在column里 可就欲哭无泪了...赔了蛋白又折column... 第六、溶液 注意一下说明书 可用的药品及浓度限制 尽量避免强酸强硷 强氧化强还原 及高urea等条件 可降低column的损坏 另外 高盐也要稍微注意一下 用完最好马上清洗 不然小心盐类结晶析出卡住管路喔~ 第七、清洁及保存 专员告诉我 如果短期(3-5天)不使用 可以用MQ水清洗保存即可 如果是长期不使用(7天以上) 最好将column用20%酒精清洗并保存 可避免微生物长出来... 当然 不同的column有各自的清洗及保存条件 所以请参照说明书喔！ 保存方面记得将开口锁好封好 免得水分挥发而有空气进入 第八、其他 其他如使用时的设定等 就看自己的实验性质了 但使用前也有一般该注意的五大点： UV光是否有开(或其他detector)？Fraction是否准备好？Buffer够吗？Protein打了吗？ Program设定对吗？ 第九、问题解决 分享两个 1.一只column使用久了 因为液体流动跟重力的关系 下面的resin一定会越来越密 这时怎麽办？ 我老板说 可以把column整只倒过来跑...均衡一下... 这是他之前实验室的方法...这我没试过... 2.如果发现管路有空气跑进column中的话怎麽办？ 说明书应该有写。我们家的那只它写说...整只倒过来跑 把空气推出... 试过 有用 但不见得全部推的出来就是了... 所以如果看到有空气 能的话赶快把机器停下 把空气排掉再继续吧 我家也只是一台小低阶的FPLC 目前能想到的大概就这些了~ 希望对大家能有帮助 祝实验顺利~!! -- 我不是业务专员 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.94.157 ※ 编辑: Fourfish 来自: 140.116.94.157 (05/10 12:42)