作者whale770909 (whale)
看板Biotech
标题[求救] western做不出来
时间Wed Mar 31 00:30:33 2010
我是跑10%SDS PAGE，样品是猪精子
使用半乾式转渍，条件是5mA/cm^2，40min
blocking 1hr
一抗则是染overnight
二抗1小时，用AP系统呈色
我的问题是，用来做control的tubulin一直出不来
一抗是使用sigma的mouse anti tubulin，稀释500倍(新买的，保存在-20，解冻不超过3次)
二抗则已经试过我们家那个放不知道几年的还有跟另一间实验室借来的二抗(确定可work)
二抗放到一千倍(正常是稀释5000倍)了，出来的只有背景跟淡到不行的band
由於这个情况以前没发生过，现在正在一个点一个点的确认
向大家请教问题有可能在哪呢?再做不出来就不用投摘要了ˊˋ
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 59.126.202.132
1F：→ ko363630:我们家是每片50mA 1hr。 这是transfer没转好吗? 03/31 00:55
2F：→ whale770909:已经用ponceau S确认过，另外这情况之前没发生过 03/31 01:08
3F：→ datro:背景 是说杂讯? ECL DECAY? 03/31 01:15
4F：→ whale770909:背景应该是因为二抗放太浓(1000X) 03/31 01:25
5F：→ whale770909:对了，两个月前一切正常 03/31 01:31
6F：推 flymon:请确定此支Ab之epitope可辨认你的样品 03/31 10:50
7F：→ flymon:另外关於你的样品中endogenous tubulin量的多寡 03/31 10:51
8F：→ flymon:可以跟别人借一个确定有明显tubulin表现的sample 03/31 10:52
9F：→ flymon:当作loading positive control 03/31 10:52
10F：→ littlesan:先确定一抗是不是认得"猪"的tubulin 03/31 22:41
11F：推 wimpy:多loading一个 你确定你的一抗可以看的很清楚的sample... 04/02 01:16
12F：推 jykonv23:blocking 1小时好像有点短的感觉 04/10 22:31