※ 引述《yaliu (雅)》之铭言： : ※ 引述《ricebaby (小苹儿)》之铭言 : : 请问各位 : : 小妹我目前准备要构筑一个质体 : : 含有分别为700bp与1.4K片段的insert(抗体的light chain&heavy chain) : : 要送入pET20b作蛋白质表现 : : 但首先我必须先利用PCR将这两段原本接在pEGFP-N1的insert P出来 : : 请问各位我该如何设计primer呢 : : 目前我想到的是 : : 1.restriction enzyme site-(NdeI)--insert1---restriction enzyme site(EcoRV) : : 2.restriction enzyme site-(EcoEV)--insert2---restriction enzyme site(XhoI) : : 因为我对了pET20b 的sequence map ,restriction Enzyme site有inframe的只有 : : EcoRV&NotI&XhoI : : 所以选择了EcoRV不知道这样设计对不对 ?? : : 然後就利用PCR将两个片段分别P出来 之後我想到的作法有两种 想请问大家的意见 : : 1.将PCR P出来的两个片段分别送到pET20b-->挑clone-->送定序 : : -->再利用EcoRV 将两个plasmid各切一刀-->ligation-->transformation-->挑clone : ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ : 不可行 : 质体最後会self-ligation--->这个不是你要的 : vector-insert1-EcoRV-insert2-vector --->这个应该是你的理想形式吧， : 但会有两个ori，不可能转形成功 : 不过可以赌赌看成功率，就是你的ligation产物，假使刚好insert1-EcoRV-insert2有成 : 你可以直接ligation产物作PCR(insert1 forword primer & insert2 reverse primer) : 但我觉得失败率挺高的.....（好像跟你第二个方法有像到） : : -->定序 : : 2.将PCR P出来的两个片段先利用EcoEV切一刀-->ligation : : -->用原本insert1的forward primer-NdeI&insert2的reverse primer-XhoI进行PCR : : 将合成的片段放大-->Enzyme digestion(NdeI&XhoI)-->ligation送入pET20b--> : : transformation-->挑clone-->sequencing : 这个比我刚刚的提议成功率高 : 不过记得设计的切点旁边要空几个mer : : 请问各位以上两个方法可以行的通吗?可以帮我分析一下优缺点吗? : : 还有其他该注意的事项吗? : : 感谢各位 我觉得第二个方法把两段insert直接接起来後 纯化 就可以直接接到vector上了 一开始用PCR放大出来的量都很大 因此你只要纯化出 1ug 的insert1+2 ligated product 就够你接到vector上好几次了(况且你只有一个地方可以黏 没有反接问题) 现在很多酵素都可以切很久 就切久一点确保反应完全嘛 之後 避免vector的自接 就用CIP吧 先把vector 5'端的phosphate拿掉 纯化出来 再和insert做ligation 产率会很高的 但记得反应完CIP的活性一定要去掉 否则会在接下来的ligation中连insert的磷酸都不见 T4 ligase一定要有一端有磷酸才能接的 不过即使你不想花钱买这个 挑个10个colony去定序 也一定会有你要的吧... P.S.PCR完你可以同时用限制酶和DpnI切 确保你最後定序不会看到template... P.S.2.你用的Pfu算是常用来做长bp的 不太需要担心PCR完序列会错 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 118.168.80.103 ※ 编辑: jason0919 来自: 118.168.80.103 (03/29 22:07)