作者jck0406 (jck)
看板Biotech
标题[求救] 为何SDS-PAGE跑出W形状的Band?
时间Wed Mar 17 19:34:04 2010
我将某片段clone完，用E. coli(BL-21)表现
vector为 pPAL7
我的目标产物为11 kDa (clone之片段2.75 + Fusion protein 8.25)
可是SDS-PAGE却跑出W形状的Band
奇怪的是，其他的Band都很正常
Fig. 1: 15% SDS-PAGE
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=jck0406&b=2&f=1974080582&p=0
Marker最下面那条绿色的band为10 kDa
(不是很清楚，有点偏蓝，不过就是W状Band旁边那条)
Lane 1, 3, 5为破菌後上清液
Lane 2, 4, 6为破菌後沉淀
跑了蛮多片SDS-PAGE，奇怪的是有时候退染太久，W状的BAND会不见
後来我怕退太久，只退染一次後，就夹在投影片中(scan用)
结果隔天W状的Band就变透明了...!
Fig. 2: 18% SDS-PAGE 变透明了!
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=jck0406&b=2&f=1974080583&p=1
Fig 3: 18% SDS-PAGE 退到有点淡，不敢再退了(不小心用破了...)
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=jck0406&b=2&f=1974080584&p=2
其实我不太知道那条W状的Band是如何产生的
不知道有没有人遇过这种情形
最後我还是搞不懂那条W状的Band到底是不是我要的产物
因为Fig 2, 3这两张的Lane1, 2是control(没加IPTG)
可是在上清液(Lane 1)还是有那条11 kDa左右的W状Band
请各位高手指点迷津~
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.127.27.213
1F：推 leoblack:应该是protein量太高而挤压变形,不然其实这还可以接受啊 03/17 21:36
2F：推 liuse:我感觉是没跑好，连上面你说正常的 我都觉得不太漂亮 03/17 22:04
3F：→ liuse:而且整条lane 有点歪歪的 03/17 22:04
4F：推 mobisrat:那不是protein 你的sample sup部分有污染到其他东西 03/17 22:20
5F：→ jck0406:to 3F，因为我目前实验室的做法，就是会在破菌後 03/17 22:44
6F：→ jck0406:直接用loading dye回溶，所以loading dye都会加很多。 03/17 22:45
7F：→ jck0406:不像其他实验室会依照比例2X or 6X稀释。 03/17 22:46
8F：→ jck0406:所以有可能是loading dye加太多吗? 03/17 22:47
9F：→ jck0406:不过这样的话我sample沉淀的部分应该也会有W型的band阿XD! 03/17 22:48
10F：推 Fourfish:蛮正常的啊 我做表现跑电泳 如果dye没跳海还蛮常看到的 03/17 22:53
11F：→ Fourfish:我都认为那只是dye的问题而已 XD 03/17 22:53
12F：推 yaliu:基本上我觉得你的sample制备可能有问题，所以band歪歪的甚 03/17 23:11
13F：→ yaliu:至有点smear。另外，你有无加IPTG皆会有那条band，所以那应 03/17 23:12
14F：→ yaliu:该不是你的产物吧....还有想问一下，破菌後沉淀是什麽意思阿 03/17 23:13
15F：→ yaliu:正常来说不都是看破菌後上清液的吗? 03/17 23:14
16F：→ licat:你可以多跑一个control, BL21[pPAL] 加IPTG induction 03/17 23:16
17F：→ yaliu:破菌後用dye回溶?上清液是液体，怎麽回溶?难道回溶沉淀物? 03/17 23:17
18F：→ licat:如果这样还是有W的band 那它就一定不是你要的东西 03/17 23:17
19F：→ yaliu:不是很了解你的意思耶 03/17 23:17
20F：→ jck0406:to yaliu，破菌後会离心，因为怕有inclusion bod 03/17 23:23
21F：→ jck0406:所以也会收集沉淀物，沉淀会直接用dye回溶 03/17 23:24
22F：→ jck0406:谢谢licat给的意见。 03/17 23:28
23F：推 yaliu:inclusion body 据说不是还要加尿素之类的吗?我没跑过啦 03/17 23:28
24F：→ jck0406: inclusion bodies 03/17 23:30
25F：→ jck0406:对阿，要纯化要加尿素或其他的药品让蛋白质重新摺叠 03/17 23:31
26F：推 tsubasawolfy:你的破菌单纯分soluble跟unsoluble吧 03/17 23:35
27F：→ tsubasawolfy:不过IB也是在unsoluble 煮一煮一样出来 03/17 23:36
28F：→ tsubasawolfy:另外要看你有没有induction出来做个time course 03/17 23:37
29F：→ tsubasawolfy:会比较容易找 03/17 23:37
30F：→ jck0406:对，是分soluble & insoluble。可是不太懂你第二句? 03/17 23:38
31F：推 tsubasawolfy:你的pellet用sample buffer回溶後也会煮吧? 03/17 23:40
32F：→ jck0406:是指纯化用加热的方式让他重新摺叠@@? 03/17 23:40
33F：→ tsubasawolfy:这边还不用探讨到refolding...要先确定到底有没有 03/17 23:41
34F：→ jck0406:对，也会煮，不过我是过有煮和没煮，结果一模一样...>"< 03/17 23:41
35F：→ tsubasawolfy:refolding要调的那些不同盐类跟pH buffer是恶梦 03/17 23:42
36F：推 tsubasawolfy:不然就放大绝用Urea破菌後过column看到底有没有(如果 03/17 23:48
37F：→ tsubasawolfy:老板不介意的话XD) 03/17 23:48
38F：推 kalfan1:W应该不是蛋白质 size也太小 03/18 04:15
39F：→ kalfan1:这胶可能做的不好 所以marker也有点歪 不是sample的问题 03/18 04:16
40F：推 bluecsky:单纯loading太多 而且看起来你没让他跑跳海 03/18 06:31
41F：→ bluecsky:还有看你没切掉的部分 你stacking的距离有够吗? 03/18 06:33
42F：→ bluecsky:不过W应该不是protein没错 可能问题在buffer中 03/18 06:35
43F：推 iceking:同一个sample做western确认到底是不是那条band 03/18 10:40
44F：→ iceking:另外inclusion body有自己的lysis方法,不要直接用dye回溶 03/18 10:41
45F：推 iceking:另外w只出现在你的上清液,可见你上清液制备有问题 03/18 10:46
46F：推 aeroufo:应该是protein没有定量吧你看每条lane的量好像不一样耶 03/18 15:53
47F：→ NKTcell:可以试试看Tricine-SDS-PAGE 03/18 17:49
48F：→ jck0406:谢谢NKTcell给的意见～ ^^ 03/18 20:57
49F：推 psychehsu:W看起来不像是protein，而且都是出现在上清液的部份 03/19 01:16
50F：→ psychehsu:会不会是上清液中含有盐类等干扰物质而影响跑胶结果 03/19 01:19
51F：推 psychehsu:检查一下破菌的buffer~ 03/19 01:27
52F：→ yangkoumi:你的样品应该不太乾净~ 03/19 19:38
53F：推 StillRick:因为会反白，所以应该不是 protein 03/20 10:24
54F：→ StillRick:因为band 有扭曲，可以知道某些样品的盐浓度相对过高 03/20 10:25
55F：→ StillRick:因为只有上清有，所以觉得是菌液中的 salt or "小东西" 03/20 10:27
56F：→ StillRick:建议是在染色前，可以先用 Q 水泡一下， 30min to 1hr 03/20 10:28
57F：→ jck0406:谢谢各位~^^ 03/20 15:29