※ 引述《itsmormon (...)》之铭言： : 第一次来贵版拜访　(因为我已经快发疯了) : 请多多指教　并救救我（跪求） : 我要侦测处理胚胎後 特定基因的表现量 : 因此用roche的软体设计real time 的primer : 这对primer在RT-PCR已经有产物 并且送定序确认过了 : 因此要以real time PCR做定量 : 但是 我的产物大小为203bp control是已经insert产物的质体 : RT PCR条件为 cDNA浓度 50ng/ul : 94度 1 min, 58度 40sec, 72度 20sec : real time PCR条件为 cDNA浓度 200ng/ul<--sales建议5x dilute : (因为50ng/ul 做不出来) : 95度 10sec, 58度 20sec, 72度 20sec <---melting curve的peak和control一样 : 但是电泳都没有band 而是smear的样子 : 40sec <---melting curve的peak比control低温 : 电泳有2个band 一个在200多 一个在300多 : 请问接下来 我要修改哪个条件?? : 谢谢大家 你们RT 与 Real time 用的PCR应是不同台吧? 有种可能是二台的温度校正不一样 有些时候不同厂商的机器会有这种问题 另一个建议是Real time PCR用的Primer尽量使用新鲜的 不要用反覆冷冻的那种 --

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