作者itsmormon (...)
看板Biotech
标题[求救] RT-PCR有产物,但Real time PCR没有产物
时间Sat Mar 6 15:44:44 2010
第一次来贵版拜访 (因为我已经快发疯了)
请多多指教 并救救我（跪求）
我要侦测处理胚胎後 特定基因的表现量
因此用roche的软体设计real time 的primer
这对primer在RT-PCR已经有产物 并且送定序确认过了
因此要以real time PCR做定量
但是 我的产物大小为203bp control是已经insert产物的质体
RT PCR条件为 cDNA浓度 50ng/ul
94度 1 min, 58度 40sec, 72度 20sec
real time PCR条件为 cDNA浓度 200ng/ul<--sales建议5x dilute
(因为50ng/ul 做不出来)
95度 10sec, 58度 20sec, 72度 20sec <---melting curve的peak和control一样
但是电泳都没有band 而是smear的样子
40sec <---melting curve的peak比control低温
电泳有2个band 一个在200多 一个在300多
请问接下来 我要修改哪个条件??
谢谢大家
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 120.107.169.145
※ 编辑: itsmormon 来自: 120.107.169.145 (03/06 15:45)
1F：推 justwhite:5x指更稀吧cDN太浓会抑制QPCR很多家都说<100ng/reaction 03/11 11:54
2F：→ justwhite:是total reaction喔!! 03/11 11:54
3F：→ justwhite:real time reagent是用哪牌的 有照他条件吗?? 03/11 11:55